李羿興,艾麥提·牙森,馬文梅,馬明福*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830054;2新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院;*通訊作者,E-mail:63319431@qq.com)

膽管癌是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤,約占消化道腫瘤的3%,根據(jù)解剖學(xué)部位可分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌[1]。膽管癌起病隱匿,早期癥狀不明顯,就診時(shí)多已屬晚期。手術(shù)切除仍然是最有效的治療方法,但目前根治性切除率相對(duì)較低,對(duì)放化療均不敏感,預(yù)后較差,故早發(fā)現(xiàn)和早診治已成為臨床面臨的難題[2]。

膽管癌是一個(gè)多因素、多階段的演變過(guò)程,其發(fā)生、發(fā)展不僅僅取決于多種癌基因的激活及抑癌基因的失活,腫瘤的微環(huán)境包括成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子在腫瘤新生血管形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用[3,4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)作為一種多功能的細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,與腫瘤微環(huán)境中信號(hào)傳導(dǎo)通路異常密切相關(guān)[5]。此外,腫瘤間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞在腫瘤分泌的多種因子刺激下被激活并表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)促進(jìn)腫瘤新生血管形成[6,7]。目前尚無(wú)TGF-β1、α-SMA與肝內(nèi)膽管癌血管形成相關(guān)的研究,故本研究通過(guò)免疫組化和qRT-PCR檢測(cè)肝內(nèi)膽管癌組織中α-SMA、CK19、TGF-β1及CD31的表達(dá),初步探討TGF-β1和α-SMA在肝內(nèi)膽管癌血管形成中的作用,為肝內(nèi)膽管癌的診治開(kāi)拓新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集2018年12月至2020年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽包蟲(chóng)科經(jīng)手術(shù)切除且病理證實(shí)的50例肝內(nèi)膽管癌患者癌組織和遠(yuǎn)端正常肝組織(離病灶中心5 cm以上)。所有患者均未接受放療、化療,臨床資料完整,術(shù)后病理分型均為腺癌。按照國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)提出TNM分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期25例,Ⅱ期14例,Ⅲ期11例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例(22%),無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例(78%)。男性32例(64%),女性18例(36%),年齡41-77歲,平均61歲。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均已簽署知情同意書。將上述組織標(biāo)本置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h,常規(guī)脫水,經(jīng)石蠟包埋后,切厚為4 μm薄片備用。

1.2 主要試劑

兔多克隆抗體α-SMA、CD31、CK19、TGF-β1,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗及DAB顯色液(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司);天狼星紅染色試劑盒(購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司);PBS緩沖液、山羊血清封閉液、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液及中性樹(shù)膠(購(gòu)自中國(guó)中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Trizole、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR(購(gòu)自大連TaKaRa公司)。

1.3 蘇木素&伊紅(HE)染色

將薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常規(guī)脫蠟,放入蒸餾水浸洗3次×5 min,隨后浸泡蘇木素溶液1.5-2 min,立即蒸餾水沖洗至泛色,用鹽酸乙醇分化2-5 s,再放入蒸餾水反藍(lán)40-60 s后浸泡伊紅溶液1-1.5 min,蒸餾水反復(fù)沖洗至泛色,常規(guī)脫水,透明并晾干,中性樹(shù)膠封片后光學(xué)顯微鏡下觀察并收集圖像。

1.4 天狼猩紅染色

將薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常規(guī)脫蠟;滴加天狼星紅染液置于37 ℃ 30 min,用無(wú)水乙醇分化2-3 s后常規(guī)脫水,透明,中性樹(shù)膠封固,在顯微鏡下觀察并采圖。使用ImageJ軟件計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 免疫組化染色

將薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常規(guī)脫蠟,用蒸餾水沖洗3次×5 min,泡在枸櫞酸抗原修復(fù)液高溫(90-100 ℃)修復(fù)15 min,自然冷卻至室溫。PBS緩沖液沖洗3次×5 min,置于3% H2O2溶液室溫孵育10 min,PBS緩沖液沖洗3次×5 min,滴加山羊血清室溫封閉1 h后滴加一抗(α-SMA 1∶500;CD31 1∶50;CK19 1∶200;TGF-β1 1∶80)置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日復(fù)溫1 h后,PBS緩沖液洗3次×5 min,滴加二抗(1∶1 000)室溫孵育90 min;PBS緩沖溶液沖洗3次×5 min后滴加適量DAB顯色液于光學(xué)顯微鏡下觀察顯色。蘇木精復(fù)染10-30 s,反復(fù)沖洗至泛色,浸泡鹽酸乙醇分化2-3 s后,用蒸餾水反藍(lán)40-60 s。最后常規(guī)脫水,透明,自然晾干后封固。顯微鏡下觀察并采圖,使用ImageJ軟件計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)mRNA水平

用Trizole試劑提取肝內(nèi)膽管癌患者癌組織和遠(yuǎn)端正常肝組織的總mRNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件:25 ℃ 10 min,42 ℃ 50 min,85 ℃ 5 min。引物序列見(jiàn)表1。按照熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書操作,擴(kuò)增條件設(shè)置:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次,72 ℃檢測(cè)信號(hào)。使用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算相對(duì)mRNA含量,ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt遠(yuǎn)端正常肝組織,2-ΔΔCt表示癌組織目的基因mRNA的相對(duì)含量較遠(yuǎn)端正常肝組織所改變的倍數(shù)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色的基本病理變化

H&E染色結(jié)果顯示,在癌組織中可見(jiàn)明顯異形性的癌細(xì)胞,細(xì)胞核大而不規(guī)則,細(xì)胞排列紊亂,伴不同程度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);而遠(yuǎn)端肝組織形態(tài)正常,可見(jiàn)正常肝小葉的結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。其中高、中分化38例(76%),低分化12(24%)例,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例(22%)。

圖1 HE染色觀察基本病理變化(×200)

2.2 纖維化相關(guān)指標(biāo)在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

天狼猩紅染色結(jié)果顯示,在癌組織中,膠原主要沉積在間質(zhì)細(xì)胞、血管或膽管周圍,而在遠(yuǎn)端肝組織中僅少量沉積(見(jiàn)圖2);定量結(jié)果顯示,癌組織與遠(yuǎn)端肝組織中膠原沉積的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖2)。此外,α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞主要位于癌組織的膽管和血管周圍,在細(xì)胞質(zhì)或間質(zhì)中高表達(dá),呈淡黃色或棕黃色;定量結(jié)果顯示,癌組織與遠(yuǎn)端肝組織中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞比例的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖3)。qRT-PCR結(jié)果提示,癌組織中α-SMA mRNA表達(dá)量較遠(yuǎn)端正常肝組織明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖3)。

圖2 天狼星紅染色檢測(cè)膠原在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

圖3 α-SMA在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

2.3 CK19標(biāo)在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,CK19陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于癌組織的膽管細(xì)胞質(zhì)中,形成部分或完整的膽管結(jié)構(gòu),呈棕褐色(見(jiàn)圖4);定量結(jié)果提示,在肝內(nèi)膽管癌組織中CK19陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于遠(yuǎn)端正常肝組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖4)。qRT-PCR結(jié)果提示,癌組織中CK19 mRNA表達(dá)量較遠(yuǎn)端正常肝組織明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖4)。

圖4 CK19在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

2.4 TGF-β1標(biāo)在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于癌組織的細(xì)胞質(zhì)或間質(zhì)中,偶見(jiàn)于胞膜或胞核著色,在膽管和血管周圍中高表達(dá),呈淡黃色或棕黃色;定量結(jié)果提示,在肝內(nèi)膽管癌組織中TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于遠(yuǎn)端正常肝組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖5)。qRT-PCR結(jié)果提示,癌組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)量較遠(yuǎn)端正常肝組織明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖5)。

圖5 TGF-β1在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

2.5 CD31標(biāo)在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,CD31陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于癌組織的細(xì)胞質(zhì)中,在血管周圍中高表達(dá),呈淡黃色或棕黃色;定量結(jié)果提示,在肝內(nèi)膽管癌組織中CD31陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于遠(yuǎn)端正常肝組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖6)。qRT-PCR結(jié)果提示,癌組織中CD31 mRNA表達(dá)量較遠(yuǎn)端正常肝組織明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖6)。

圖6 CD31在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

2.6 在肝內(nèi)膽管癌組織中所表達(dá)指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,α-SMA與CK19、TGF-β1、CD31,CK19與TGF-β1、CD31,TGF-β1與CD31在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(均P<0.01,見(jiàn)表2)。

表2 肝內(nèi)膽管癌組織中所表達(dá)的各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

3 討論

肝內(nèi)膽管癌是一種原發(fā)于肝臟的常見(jiàn)惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞性肝癌并逐年升高[8]。膽管癌的發(fā)生在膽管細(xì)胞增殖、分化和正常凋亡異常等遺傳因素和表觀遺傳因素的共同作用下導(dǎo)致原癌基因和抑癌基因之間失衡[9]。大多數(shù)患者未及時(shí)發(fā)現(xiàn),病情發(fā)展迅速,嚴(yán)重威脅患者生命。因此,研究肝內(nèi)膽管癌發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制顯得尤為重要。

研究表明,新生血管的形成不僅為腫瘤細(xì)胞的異常生長(zhǎng)提供必要的氧氣,而且促進(jìn)癌細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至其他組織器官[10]。癌組織微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤細(xì)胞新生血管形成、增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起了至關(guān)重要的作用[11]。TGF-β1作為在腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮多種關(guān)鍵作用的生物學(xué)效應(yīng)分子,在多種惡性腫瘤組織均有高表達(dá),其表達(dá)水平與惡性腫瘤的演進(jìn)、血管的形成、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12,13]。成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞,在TGF-β1的作用下可激活。激活的成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA并發(fā)生表型的改變,可以表達(dá)多種細(xì)胞因子,從而改善腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤血管生成[14]。此外,膽管癌晚期高表達(dá)的TGF-β1能抑制免疫系統(tǒng)的正常功能,刺激新生血管的形成或通過(guò)旁分泌抑制癌細(xì)胞周圍組織的過(guò)度增殖,減少癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的空間限制,為癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的環(huán)境[15,16]。

本研究結(jié)果表明,在肝內(nèi)膽管癌患者癌組織中可見(jiàn)明顯異形性的癌細(xì)胞,細(xì)胞核大,細(xì)胞排列紊亂,伴有不同程度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),提示淋巴細(xì)胞參與肝內(nèi)膽管癌腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成[17]。天狼猩紅染色觀察組織中的膠原沉積情況,結(jié)果顯示,膠原主要沉積在肝內(nèi)膽管癌組織的血管、膽管周圍,表明膠原沉積對(duì)肝內(nèi)膽管癌血管的形成至關(guān)重要,這與近期研究結(jié)果一致[18]。本研究觀察到50例肝內(nèi)膽管癌患者癌組織中高表達(dá)α-SMA、CK19、TGF-β1、CD31,而遠(yuǎn)端正常肝組織中僅有少量表達(dá)。上述指標(biāo)在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān),提示α-SMA和TGF-β1在肝內(nèi)膽管癌血管形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

總之,TGF-β1和α-SMA是肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素,直接或間接參與肝內(nèi)膽管癌血管的形成。隨著對(duì)TGF-β1、腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞及所分泌細(xì)胞因子的深入研究,將對(duì)探討肝內(nèi)膽管癌血管形成、發(fā)病機(jī)制及診治產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義,靶向抑制腫瘤微環(huán)境中的血管形成有望成為肝內(nèi)膽管癌診治的新策略。