李靜 柳鴻敏 侯程程 吳東林 楊顯達(dá)

流感病毒是引起人類呼吸道感染的常見(jiàn)病原，是人類面臨的主要公共健康問(wèn)題之一［1］，每年都會(huì)造成3 000～5 000 萬(wàn)人感染呼吸道疾病，導(dǎo)致25～50 萬(wàn)人死亡，給全球帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。甲型H3N2亞型流感首次大爆發(fā)發(fā)生于1968年并引起20世紀(jì)的第三次流感大流行，造成約300萬(wàn)人死亡，又被稱為“香港流感”。從此后甲型H3N2 亞型流感一直在人群中呈季節(jié)性流行并逐年發(fā)生變異，較H1N1pdm 亞型和乙型流感病毒，H3N2 亞型抗原進(jìn)化快，感染癥狀重，更易引起流行［3?4］。目前流感的防治措施主要是疫苗接種和抗流感病毒藥物，流感疫苗接種用于預(yù)防流感，抗流感病毒藥物用于預(yù)防性用藥和臨床治療?？沽鞲胁《舅幬镏饕∕2 離子通道阻斷劑，即金剛烷胺類藥物［5］，如金剛烷胺、金剛乙胺，以及靶向神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物（neuraminidase inhibitor，NAI），如奧司他韋、扎那米韋等［6］。由于抗病毒藥物的廣泛使用以及流感病毒的不斷變異，流感病毒耐藥株呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，為更好的指導(dǎo)臨床用藥和治療，對(duì)流感毒株的耐藥性監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。為了解吉林省甲型H3N2 亞型流感病毒的耐藥基因特征及耐藥情況，本研究對(duì)流感毒株進(jìn)行M2 和NA 基因擴(kuò)增并進(jìn)行了基因序列比對(duì)，分析吉林省甲型H3N2 亞型流感病毒毒株的耐藥位點(diǎn)變化。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

采集2018年4月至2020年3月吉林省內(nèi)13家國(guó)家級(jí)流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院具有流感樣癥狀（體溫≥38℃，伴咳嗽或者咽痛之一）的流感樣病例標(biāo)本，發(fā)熱3 天內(nèi)患者的咽拭子或鼻咽拭子。

1.2 方法

1.2.1 核酸檢測(cè)

使用用QIAamp Viral RNA kit（Qiagen）試劑盒（貨號(hào)：52904）提取核酸，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。使用Thermo fisher 公司AgPath?IDTMOne?Step RT?PCR Reagent Kit 進(jìn)行流感病毒亞型Real?time PCR 檢測(cè)，相關(guān)引物及探針序列參考《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南（2017年版）》［7］，檢測(cè)所使用的引物及探針序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2 流感病毒分離與鑒定

核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本接種于狗腎細(xì)胞（MDCK）對(duì)進(jìn)行流感病毒分離。7 天內(nèi)發(fā)生細(xì)胞病變的細(xì)胞使用紅細(xì)胞凝集方法進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)于HA≥1∶8 的毒株進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)對(duì)流感病毒亞型進(jìn)行鑒定，鑒定試劑由國(guó)家流感中心提供。所有毒株均經(jīng)過(guò)國(guó)家流感中心復(fù)核鑒定后用于本研究分析。

1.3 病毒選擇

隨機(jī)挑選2018?2020年流感監(jiān)測(cè)年度34 株甲型H3N2 亞型流感毒株。

1.4 序列擴(kuò)增

流感毒株進(jìn)行核酸提取后，使用上海伯杰公司季節(jié)性流感病毒H3N2 亞型全基因擴(kuò)增試劑盒對(duì)M 和NA 基因進(jìn)行擴(kuò)增。按照試劑說(shuō)明書(shū)配制PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：50℃30 min；94℃3 min；35 個(gè)循環(huán)（94℃30 s，60℃30 s，72℃1.5 min）；72℃7 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳。電壓80 V，電泳時(shí)間為40 min，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果，將陽(yáng)性條帶送公司測(cè)序。

1.5 序列分析

采用Bioedit 和Mega7.0 分析軟件對(duì)M2 基因和NA 基因進(jìn)行比對(duì)、分析核酸序列和氨基酸序列。以WHO 北半球H3N2 流感疫苗推薦株A/Sin?gapore/INFIMH?16?0019/2016（2018?2019），A/Kan?sas/14/2017（2019?2020）作為參比序列（來(lái)源于GI?SAID 數(shù)據(jù)庫(kù)）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用Excel 工作表對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、匯總、分類以及比例計(jì)算。采用Bioedit 和Mega7.0 分析軟件對(duì)M2 基因和NA 基因進(jìn)行比對(duì)、分析核酸序列和氨基酸序列。

2 結(jié)果

2.1 甲型H3N2 流感流行情況

2018?2020年度，吉林省共采集流感樣病例標(biāo)本17 930 份，分離到流感毒株981 株，其中甲型流感病毒毒株934 株，乙型流感毒株47 株。在分離到的甲型流感病毒毒株中，57.49%為H1N1pdm 亞型毒株，39.61%為H3N2 亞型毒株。見(jiàn)表1。

2.2 M2 基因耐藥位點(diǎn)分析

吉林省2018?2020年度34 株H3N2 亞型流感病毒在M2 耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)L26F、V27A、A30T、G34E 均未發(fā)生突變，但全部在S31N 基因位點(diǎn)上發(fā)生了突變，即對(duì)金剛烷胺類抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥。見(jiàn)圖1。

2.3 NA 基因耐藥位點(diǎn)分析

吉林省2018?2020年度34 株H3N2 亞型流感病毒在NA 耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K、N294S 及R371K 均未發(fā)生突變，即對(duì)NAI 敏感。見(jiàn)圖2。

圖1 M2 基因耐藥位點(diǎn)比對(duì)結(jié)果Figrue 1 Comparison results of drug resistance sites of the M2 gene

圖2 2018?2020年吉林省H3N2 亞型流感毒株NA 基因氨基酸耐藥位點(diǎn)突變情況Figure 2 Amino acid mutation relate with neuraminidase resistance of H3N2 influenza strains in Jilin Province during 2018?2020

3 討論

流行性感冒一直以來(lái)嚴(yán)重威脅人類健康，流感病毒是正粘病毒科，分為甲（A）、乙（B）、丙（C）、?。―）4 型［8］，其中甲、乙兩個(gè)型別是季節(jié)性流感的主要病原。甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行。流感疫苗是預(yù)防流感病毒感染的最主要手段［9］，由于H3N2 亞型很難在雞胚中生長(zhǎng)良好，且在抗原決定簇區(qū)域發(fā)生數(shù)個(gè)雞胚適應(yīng)性突變，與流行株的抗原特性有差異［10］，另外病毒快速和顯著的變異，也阻止機(jī)體產(chǎn)生持久的保護(hù)性免疫［11］?？共《舅幬镏饕糜诹鞲兄委熞约氨┞逗蟮念A(yù)防用藥。M2 離子通道阻斷劑已經(jīng)在臨床應(yīng)用大約六十年了，自從2019年H1N1 流感大流行時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)耐藥情況［12］。自2000年代中期以來(lái)，H3N2 亞型也已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)耐藥性。為掌握吉林省內(nèi)H3N2 亞型流感流行株對(duì)金剛烷胺類藥物以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物的耐藥情況，開(kāi)展本次研究。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，與M2 基因耐藥有關(guān)的分子標(biāo)記有L26F、V27A、A30T、S31N 和G34E，其中任何一個(gè)發(fā)生變異，金剛烷胺類藥物則無(wú)法與M2 蛋白離子通道結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。本次研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［5，13］。NA 基因耐藥有關(guān)的分子標(biāo)記有E119V/I、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K、N294S 和R371K，只要其中任意位點(diǎn)發(fā)生突變，病毒即對(duì)NAI 產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象［14?15］。其中NA 基因第274 位和294 位突變導(dǎo)致對(duì)奧司他韋和帕拉米韋耐藥，第119 位突變導(dǎo)致對(duì)奧司他韋和扎扎那米韋耐藥［12］。但仍然要保持高度重視，由于神經(jīng)氨酸酶抑制劑在臨床中的廣泛應(yīng)用及H3N2 流感病毒的不斷變異，已在臨床中出現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感染度降低的病例［16?17］，以及由于NA 基因上H275Y 的變異導(dǎo)致出現(xiàn)澳大利亞、日本等國(guó)家A（H1N1）pdm09 耐藥毒株的聚集性病例和散發(fā)病例［18］。在臨床治療中，應(yīng)選擇多種治療方式聯(lián)合使用，減少藥物壓力產(chǎn)生的耐藥株，同時(shí)堅(jiān)持長(zhǎng)期、持續(xù)的流感毒株耐藥性監(jiān)測(cè)，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)本省內(nèi)藥物敏感度降低的毒株，為流感的防控以及指導(dǎo)抗流感藥物的選擇和使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。