許 永，黃海濤，李 晶，劉 欣，王 晉，楊葉昆，孔維松

（云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，昆明 650106）

紫蘇（Perilla frutescens）是唇形科一年生草本自花授粉植物，具有特異芳香［1］，在醫(yī)藥、食品等領域有重要的開發(fā)價值［2］。紫蘇具有抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗艾滋病等多種生理活性［3，4］。紫蘇揮發(fā)油是紫蘇葉的主要活性成分，含紫蘇醛、紫蘇酮等成分，已廣泛用于食品、皂用香精及化妝品加香，在煙草中加入紫蘇配方可改善煙草的吸味、增加煙草甜香，改善干、澀、苦口感，滿足消費者要求。紫蘇葉是制備芳香揮發(fā)油的主要器官部分［5］，近年來，紫蘇葉揮發(fā)性成分也已成為食品、醫(yī)療等領域研究的熱點之一。因此，研究紫蘇葉的揮發(fā)性成分具有重要意義。

紫蘇揮發(fā)物提取多采用水蒸氣蒸餾法［6-8］、同時蒸餾萃取法［9］、超臨界 CO2提取法［10，11］、固相微萃?。?2，13］、吹掃捕集［14］等方法，多數采用氣相色譜質譜［7，14］對揮發(fā)物組成進行測定，有的也采用電子鼻［15］、全二維氣相色譜-飛行時間質譜［16］等。水蒸氣蒸餾提取法和超臨界CO2提取法二者都存在樣品用量大、費時及提取成本高等缺點，同時蒸餾萃取可導致某些欠穩(wěn)定組分長期和熱水反應分解，造成小分子揮發(fā)物損失，結果重現性差。固相微萃取法和吹掃捕集無需溶劑與前處理，從樣品中直接采集揮發(fā)性成分，能更好地體現被檢測揮發(fā)物的真實組成［17］，但重現性較差。溶劑萃取法操作簡單、經濟實用、提取效率高。對固體物質的萃取通常采用冷浸法或熱浸法（索氏提取器），冷浸法是靠溶劑長時間的浸潤溶解從而將溶劑中的可溶物質浸提出來；熱浸法是利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質被純溶劑持續(xù)提取，但在提取過程中大量雜質會隨揮發(fā)性成分一起溶出，影響分析結果，而且在提取過程中很難避免揮發(fā)性成分損失。

現有的方法均無法滿足紫蘇揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分準確分析和客觀評價的要求。本研究對樣品前處理方法進行改進，設計了如圖1所示的帶固相萃取功能的索氏提取裝置，該裝置于密閉環(huán)境進行加熱萃取，集萃取、凈化和濃縮為一體，中途不需要轉移樣品，大大簡化了樣品前處理操作，有效縮短了樣品前處理周期。該方法的建立為紫蘇揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分提供了快速、可靠的分析方法，為紫蘇葉精油質量控制提供參考，并可對卷煙生產企業(yè)日常調香工作的開展起參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：紫蘇葉原料購自云南鴻翔一心堂藥業(yè)（集團）股份有限公司。

儀器：高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Agilent 6890-5973N氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；ME414S型電子天平，德國Sarto?rius公司，感量0.000 1 g；自主研發(fā)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置（圖1）。

試劑：二氯甲烷，色譜純，美國Dicma公司；柱色譜硅膠，200～300目，青島海洋化工廠；無水硫酸鈉，AR，天津化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1）紫蘇葉樣品處理。將購買的紫蘇葉經高速萬能粉碎機粉碎，過孔徑為450 μm的標準檢驗篩，得均勻粉末。

2）樣品提取。在固相萃取柱中加入10 g硅膠（200～300目），稱取20 g紫蘇葉樣品于樣品筒中，在樣品上方覆蓋一層無水硫酸鈉后，夾緊密封，將色譜進樣瓶與圓底燒瓶的螺紋接口密封連接，并在燒瓶中加入200 mL二氯甲烷溶劑，然后將燒瓶置于水浴鍋中，50℃加熱，冷凝回流3 h后，切換三通閥，使其與外界空氣導通，不斷揮發(fā)的溶劑通過三通閥流出并回收，達到濃縮的目的，當色譜進樣瓶中的樣品溶液蒸發(fā)至約1 mL后，旋下色譜進樣瓶即可進行GC-MS分析。

1.2.2 氣相色譜條件 DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣量 1.0 μL；柱流量 1.0 mL/min；分流比 10∶1；進樣口溫度 260℃；程序升溫條件：50℃保持 2 min再以 5℃/min升至 220℃，再以10℃/min升至250℃，保持10 min。

1.2.3 質譜條件 電子轟擊離子源E1；離子化電離能70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度280℃；質量掃描范圍 50～350 amu；WILEY、NIST 譜庫進行檢索。

2 結果與分析

2.1 帶固相萃取功能的索氏提取裝置設計及工作原理

樣品前處理裝置結構見圖1。工作原理：啟動水浴鍋加熱，溶劑蒸發(fā)后經密閉冷凝管冷凝回流到樣品筒中，溶劑先經無水硫酸鈉層干燥，然后對樣品進行提取，提取液經過硅膠柱凈化后回流至燒瓶中。經過一段時間的回流提取后，調整三通閥與外界空氣導通，不斷揮發(fā)的溶劑通過三通閥流出并回收，此時燒瓶中的溶液不斷被濃縮，當濃縮至約1 mL時停止加熱，卸下色譜進樣瓶即可進行分析。

帶固相萃取功能的索氏提取裝置可在密閉條件下對樣品進行分離、提純、濃縮，無需多次轉移、濃縮的操作步驟，大大提高了提取效率。此外，本裝置采用全封閉的冷凝管，有效避免了提取溶劑的揮發(fā)損失，大大降低了樣品前處理過程對實驗室環(huán)境造成的污染，密閉冷凝器帶有泄壓閥，壓力過高時可自動泄壓，有效避免因壓力過高對提取裝置造成的損壞；裝置在溶劑回流管中設置三通閥，通過切換閥門可直接切換樣品回流提取和濃縮，整個操作流程不需轉移樣品。裝置還設計了連接色譜進樣瓶接口的圓底燒瓶，樣品濃縮完成后，旋下色譜進樣瓶即可直接進行分析，避免常規(guī)樣品尾管濃縮燒瓶濃縮完后，需用吸管將尾管中的溶液取出并洗滌尾管和吸管的步驟，進一步簡化了樣品前處理操作。

2.2 樣品前處理條件的確定

2.2.1 提取試劑優(yōu)化 采用本研究設計的帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取紫蘇樣品，分別用正己烷和二氯甲烷進行提取，分析對比提取液GC-MS總離子流。結果表明，2種提取試劑中，二氯甲烷溶劑萃取得到的化學成分種類更多，色譜峰面積較大，故選用二氯甲烷作為提取溶劑。

2.2.2 提取時間優(yōu)化 按照樣品前處理方法，采用本研究設計的帶固相萃取功能的索氏提取裝置分別提取紫蘇樣品 1、2、3、4、5 h，分析對比不同提取時間得到的提取液GC-MS總離子流。結果表明，提取3 h后，總離子流中化學成分種類及色譜峰面積基本保持不變，為保證目標物提取完全，選擇提取時間為3 h。

2.2.3 固相萃取填料用量優(yōu)化 索氏提取過程中大量雜質會隨揮發(fā)性成分一起溶出，因此本研究對傳統(tǒng)索氏提取裝置進行了改進，于索氏提取裝置中增設了固相萃取柱，采用硅膠作為固相萃取填料吸附提取液中的雜質，并對硅膠用量進行優(yōu)化。在固相萃取柱中分別加入 5、10、20、30 g硅膠顆粒（200～300目），在樣品筒中加入20 g紫蘇樣品，以二氯甲烷為提取溶劑，50℃加熱，冷凝回流3 h，分析對比提取液GC-MS總離子流。結果表明，硅膠用量為5 g時，提取液總離子流中化學成分種類較多，經檢索后各物質匹配度均不高，且色譜峰面積明顯小于另外3種硅膠用量，可能是由于硅膠用量較少，沒有達到明顯的凈化效果；硅膠用量為10和20 g時，提取液總離子流中化學成分種類及色譜峰面積沒有明顯變化；硅膠用量為30 g時，提取液總離子流中化學成分種類及色譜峰面積略低于10和20 g的硅膠用量，可能是由于硅膠用量較大時吸附了部分揮發(fā)性成分。為了實現提取液的有效凈化，選擇10 g硅膠作為填充量。

2.3 紫蘇揮發(fā)性成分分析

紫蘇提取液進行GC-MS分析，相應的質譜總離子流如圖2所示，揮發(fā)性成分用WILEY、NIST譜庫進行檢索，相對含量利用峰面積歸一法進行計算。以二氯甲烷為溶劑，采用自制的帶固相萃取功能的索氏提取裝置從紫蘇葉中提取揮發(fā)性成分，經GCMS分析，共鑒定出75種揮發(fā)性物質，主要包括烯烴類、醇類、酮類等（表1）。由表1可以看出，檢出烯烴類化合物最多（28種），總含量為14.63%，含量較高的成分主要有石竹烯（8.38%）、Z，E-α-法尼烯（1.40%）、律草烯（1.19%）、1，3-二異丙基-1，3-環(huán)戊二烯（1.01%）等；醇類化合物次之（13種，含量4.90%），含量最高的成分是芳樟醇（1.94%）；酮類化合物有12種，含量高達65.75%，含量較高的成分主要有紫蘇酮（56.16%）、異脫氫紫蘇酮（8.11%）等；有機酸有4種，含量為1.87%，含量最高的成分是棕櫚酸（1.41%）；其他還有少量酚類化合物（2種）、醛類化合物（3種）、酯類化合物（3種）、醚類化合物（1種）、烷烴類物質（3種）、其他物質（6種）等。

圖2 紫蘇揮發(fā)性化學成分總離子流

從表1中還可以看出，從紫蘇葉提取物中得到45種香味成分，占揮發(fā)性物質相對含量的88.66%。這些香味成分協(xié)調配伍，賦予了紫蘇特殊的香氣。

紫蘇提取物中部分揮發(fā)性物質還具有一定的藥用活性，如含量最高的紫蘇酮不僅具有特異的芳香氣味，還能通過干擾細菌的代謝達到抗菌抑菌效果，同時還能增加小腸推進力起到解魚蟹毒的作用［18］；紫蘇醛具有獨特的藥用效果，如抗衰老、降血脂、抗過敏炎癥等功能；子丁香酚具有抗菌、健胃、降血壓的作用；D-檸檬烯作為特征香氣成分之一，不僅能

廣泛應用于食用香精中，還能通過抑制蛋白質異戊烯化來預防和抑制腫瘤的發(fā)生，具有抗癌作用；芳樟醇具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性［19］；欖香烯是一種抗癌成分，用于治療腦癌、肺癌和消化道腫瘤等［20］；洋芹醚有催眠、鎮(zhèn)靜和抑菌作用［21］；石竹烯廣泛應用于食品香料方面，同時還兼?zhèn)潇钐抵箍取⑾練⒕乃幱脙r值，是治療老年支氣管炎的有效成分［22］。

表1 紫蘇揮發(fā)性化學成分分析結果

續(xù)表1

續(xù)表1

2.4 方法重復性

為了考察該方法的精密度，對紫蘇樣品進行了7次日內重復測定，同時進行了7 d的重復性試驗，選取紫蘇酮、石竹烯、異脫氫紫蘇酮、石竹烯氧化物、棕櫚酸、芳樟醇作為標記物，考察重復性，結果見表2，日內測定的相對標準偏差為2.5%～4.3%，日間測定的相對標準偏差在2.8%～4.8%，測定結果具有很好的重現性，表明該方法的日內和日間精密度較好。

3 結論

針對目前索氏提取前處理操作復雜、萃取過程大量雜質會隨揮發(fā)性成分一起溶出影響檢測等問題，本研究設計開發(fā)了一種新型的集提取、凈化、濃縮及轉移功能為一體的帶固相萃取功能索氏提取裝置，中途不用轉移樣品，密閉環(huán)境進行加熱萃取，大大簡化了樣品前處理操作，有效縮短了樣品前處理周期，為紫蘇揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分提供了快速、可靠的分析方法。

表2 方法重復性試驗結果（n=7）

利用自主設計的帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取紫蘇中的揮發(fā)性成分，采用GC/MS聯(lián)用技術分析鑒定出75種揮發(fā)性組分，其中具有香味的成分有45種，這些成分具有的特征香氣，可用于香精、香料及制藥，具有很高的開發(fā)利用價值。