劉麗，康安，劉春樣，田磊，劉志輝，沈洪

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)屬于炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)，是一種主要累及大腸黏膜、黏膜下層的慢性炎癥性腸道疾病，表現(xiàn)有體質(zhì)量減輕、腹瀉、直腸出血和腹痛[1]。UC患者生活質(zhì)量差，病情常反復(fù)發(fā)作，但是臨床上西醫(yī)用藥及治療手段種類有限、療效欠佳，且預(yù)后很難判斷。沈洪教授借鑒金代名醫(yī)劉完素治療“久痢”理法原則，將經(jīng)方芍藥湯加減化裁而成清腸化濕方，在臨床實(shí)踐中治療濕熱蘊(yùn)腸、氣血不調(diào)為主的活動(dòng)期UC患者，可以很好地改善UC患者臨床癥狀，降低復(fù)發(fā)率[2]。前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示清腸化濕方具有良好的抗炎、降低血管通透性和鎮(zhèn)痛功效[3]。葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的UC造模簡(jiǎn)單且與人類UC具有高度相似性，經(jīng)常用于研究UC的發(fā)病機(jī)理[1]。本文擬通過清腸化濕方干預(yù)治療DSS制備的小鼠急性期UC模型，進(jìn)一步探討清腸化濕方治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及主要試劑 清腸化濕方由黃芩10 g，黃連6 g，煨木香6 g，炒當(dāng)歸10 g，地榆10 g，炒白芍15 g，白芷10 g，甘草6 g等組成，購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院劉志輝教授鑒定為正品。上述飲片加入10倍量的水，浸泡1 h后，加熱煎煮1 h，濾過；藥渣再加8倍量水，煎煮1 h，濾過；合并2次濾液，減壓濃縮，制成生藥濃度為3.776 g/mL的制劑。DSS(平均分子量：36 000～50 000)為MP Biomedicals公司產(chǎn)品，用無菌飲用水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的溶液用于實(shí)驗(yàn)。柳氮磺胺吡啶(Salicylazosulfapyridine，SASP)購(gòu)自上海信誼天平藥業(yè)有限公司，用0.5% CMC-Na溶液配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL用于實(shí)驗(yàn)。IL-6和TNF-α ELISA試劑盒為Biolegend公司產(chǎn)品。BCA試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。EZNA Stool DNA Kit為Omega Bio-tek公司產(chǎn)品，TransStartFastPfuDNA Polymerase為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，AxyPrep DNA GelExtraction Kit為Axygen Biosciences公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL小鼠，8周齡，18～22 g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 方法

1.2.1 DSS誘導(dǎo)制備小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型及藥物干預(yù) 實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，稱小鼠體質(zhì)量，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control)、模型組(DSS)、清腸化濕方組(QCHS)和柳氮磺胺吡啶組(SASP)，每組10只小鼠。模型組和治療組小鼠自由飲用3%DSS溶液5 d，第6天更換無DSS飲用水至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。正常對(duì)照組小鼠飲用水不含有DSS。柳氮磺胺吡啶組于造模當(dāng)日開始進(jìn)行柳氮磺胺吡啶(每10 g小鼠體質(zhì)量灌胃0.1 mL)飼喂至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，清腸化濕方組于造模前1 d開始給小鼠灌胃給藥(33.8 g/kg)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，模型組一直飼喂生理鹽水。分別于造模第0、2、4、6、8、9天進(jìn)行小鼠體質(zhì)量稱量。造模第9天處死小鼠，分離小鼠脾臟并稱質(zhì)量，分離小鼠結(jié)腸并量取結(jié)腸長(zhǎng)度，收集小鼠結(jié)腸內(nèi)腸道內(nèi)容物。

1.2.2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 取福爾馬林固定后的小鼠結(jié)腸組織，按順序依次進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟至水后行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜組織損傷情況。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中IL-6和TNF-α的含量 結(jié)腸經(jīng)勻漿后的上清液適當(dāng)稀釋后，按試劑盒所述方法，經(jīng)上樣、孵育、洗板、封板，加入各自的底物顯色劑、終止液檢測(cè)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出IL-6和TNF-α的含量，根據(jù)稀釋倍數(shù)及結(jié)腸上清液的蛋白濃度校正后，得出IL-6和TNF-α最終含量。

1.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)檢測(cè)小鼠腸道內(nèi)丁酸、異丁酸的含量 檢測(cè)方法由一步法衍生，參照文獻(xiàn)[4]：在水、丙醇和吡啶(8∶3∶2)的反應(yīng)系統(tǒng)中，加入氯甲酸丙酯100 μL，用己烷兩步萃取法提取。Agilent 7890A氣相色譜-安捷倫5975C惰性色譜系統(tǒng)XL EI/CI質(zhì)譜檢測(cè)器(GC-MS)分析生物樣品中的丁酸(Butyric acid，BA)、異丁酸(Isobutyric acid，IBA)的含量。衍生品分離使用涂覆有5%苯基，95%甲基聚硅氧烷(30 m i.d.、0.25 μm膜厚)毛細(xì)管柱。電子能量設(shè)定為-70 V，全掃描模式(m/z30～600)收集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分析丁酸、異丁酸在小鼠腸道內(nèi)容物中的含量。

1.2.5 小鼠糞便微生物DNA提取、PCR反應(yīng)、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析 根據(jù)試劑盒說明書操作步驟，使用E.Z.N.A. Stool DNA Kit提取正常對(duì)照組、模型組和清腸化濕方組小鼠糞便中微生物DNA。DNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)合格后，對(duì)DNA樣本進(jìn)行16S核糖體RNA基因V3～V4(341F-806R)區(qū)域的PCR擴(kuò)增。引物341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'，806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'。PCR反應(yīng)體系包含4 μL 5×FastPfuBuffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL上游引物(5 μmol/L)、0.8 μL下游引物(5 μmol/L)、0.4 μLFastPfuDNA Polymerase和10 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃初始變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物使用AxyPrep DNA Gel extraction kit純化。純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Illumina PE250文庫(kù)構(gòu)建、Illumina PE250測(cè)序。對(duì)測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以上工作委托上海凌恩生物科技有限公司完成。Illumina PE250測(cè)序獲得的序列，對(duì)Reads的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，對(duì)質(zhì)控拼接好的序列按照97%相似性進(jìn)行OTU聚類分析?；贠TU聚類分析結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)分析、測(cè)序深度的檢測(cè)，基于分類學(xué)信息在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)所獲得的小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度、脾臟質(zhì)量、促炎因子和丁酸含量等數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件One-WayANOVA方法進(jìn)行分析。各組小鼠腸道內(nèi)的菌群豐度統(tǒng)計(jì)比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCoA統(tǒng)計(jì)分析采用R語言完成。

2 結(jié)果

2.1 清腸化濕方對(duì)UC小鼠一般情況的影響

與模型組比較，清腸化濕方組和柳氮磺胺吡啶組可以不同程度地改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癥狀，使大部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大便性狀、毛色、精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。各組小鼠在造模當(dāng)天體質(zhì)量無顯著差別。在第6、8、9天，模型組與正常組相比，體質(zhì)量顯著降低(P<0.01)。在第8、9天，柳氮磺胺吡啶組與模型組相比，體質(zhì)量顯著升高(P<0.05～0.01)；清腸化濕方組與模型組相比，體質(zhì)量顯著升高(P<0.05～0.01)(圖1a)。

2.2 清腸化濕方對(duì)UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

模型組小鼠與正常組小鼠相比，結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短(P<0.01)。清腸化濕方組和柳氮磺胺吡啶組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著大于模型組小鼠(P<0.01)(圖1b)。

2.3 清腸化濕方對(duì)UC小鼠脾臟質(zhì)量的影響

與正常組相比，模型組脾臟質(zhì)量顯著增加(P<0.01)；清腸化濕方組(P<0.01)和柳氮磺胺吡啶組(P<0.01)小鼠脾臟質(zhì)量顯著低于模型組(圖1c)。

2.4 清腸化濕方對(duì)UC小鼠結(jié)腸病理的影響

如圖1d所示，正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整清晰，隱窩結(jié)構(gòu)正常、杯狀細(xì)胞未見破壞，散在或少量炎性細(xì)胞位于固有層間質(zhì)。模型組、清腸化濕方組和柳氮磺胺吡啶組小鼠結(jié)腸都表現(xiàn)出不同程度的炎癥和黏膜損傷，且這些損傷在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間都未得到完全恢復(fù)。其中，模型組小鼠結(jié)腸組織炎癥、黏膜損傷程度最重，腸道上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，隱窩結(jié)構(gòu)受到損壞，黏膜和黏膜下層有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。和模型組相比，清腸化濕方組和柳氮磺胺吡啶組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)得到改善，黏膜損傷程度減輕，隱窩結(jié)構(gòu)較為正常，腸道上皮和杯狀細(xì)胞數(shù)量減少得到改善，固有層炎癥減輕。

注：Control.正常對(duì)照組;DSS.模型組;SASP.柳氮磺胺吡啶組;QCHS. 清腸化濕方組。黑色箭頭指向病理?yè)p傷及文中描述病理部位(HE, ×200)。與模型組比較，

2.5 清腸化濕方對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織IL-6、TNF-α水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，清腸化濕方組小鼠結(jié)腸組織IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.01)；柳氮磺胺吡啶組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(圖2)。

2.6 清腸化濕方對(duì)UC小鼠結(jié)腸腸道內(nèi)容物中丁酸、異丁酸含量的影響

如圖3顯示，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸腸道內(nèi)容物中丁酸、異丁酸含量均顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，清腸化濕方組小鼠結(jié)腸腸道內(nèi)容物中丁酸、異丁酸含量均顯著升高(P<0.05)；柳氮磺胺吡啶組小鼠的結(jié)腸腸道內(nèi)容物中異丁酸含量顯著增加(P<0.01)。

注：Control.正常對(duì)照組；DSS.模型組；SASP.柳氮磺胺吡啶組； QCHS.清腸化濕方組。與模型組比較，圖2 清腸化濕方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠結(jié)腸組織IL-6、 TNF-α水平的影響

注：Control.正常對(duì)照組;DSS.模型組;SASP.柳氮磺胺吡啶組; QCHS.清腸化濕方組;BA.丁酸，IBA.異丁酸。與模型組比較，

2.7 實(shí)驗(yàn)小鼠糞便菌群的稀釋性曲線和物種累積曲線分析

本次實(shí)驗(yàn)稀釋性曲線(圖4a)趨向平坦，表示更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，說明本研究測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，樣本測(cè)序深度充分。物種累積曲線(圖4b)趨于平緩，表示本次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的物種不會(huì)隨樣本量的增加而顯著增多，說明本次實(shí)驗(yàn)樣本量充分。

2.8 實(shí)驗(yàn)小鼠糞便菌群的alpha多樣性分析

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用來定量描述樣本的生物多樣性。Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。如圖4c和4d所示，與正常對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠糞便菌群的多樣性降低；清腸化濕方藥物干預(yù)治療后，小鼠糞便菌群的多樣性較模型組增加，接近于正常對(duì)照組，提示DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠表現(xiàn)出腸道菌群失調(diào)，清腸化濕方可以通過提高腸道菌群多樣性，在一定程度上保持腸道菌群多樣性平衡。

注：a.稀釋性曲線；b.物種累積曲線；c.Shannon指數(shù)圖；d.Simpson指數(shù) 圖。C1～C6.正常對(duì)照組樣本;M1～M6.模型組樣本;L1～L6.清腸化 濕方組樣本。Control.正常對(duì)照組;DSS.模型組;QCHS.清腸化濕方組。

2.9 實(shí)驗(yàn)小鼠糞便菌群的主坐標(biāo)分析(PCoA)分析

PCoA是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性，樣本距離越接近表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。本研究通過PCoA作圖發(fā)現(xiàn)正常組、模型組和清腸化濕方組的菌群樣本分布在不同區(qū)域，同組樣品分布在相近區(qū)域內(nèi)(圖5)，提示各組間腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異性。

注：紅色C1～C6.正常對(duì)照組;綠色M1～M6.模型組; 藍(lán)色L1～L6.清腸化濕方組，n=6。

2.10 清腸化濕方對(duì)UC模型小鼠腸道菌群豐度的影響

通過對(duì)測(cè)序樣品的序列進(jìn)行比對(duì)分析，各組小鼠的糞便菌群主要屬于5個(gè)菌門，包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)，這5個(gè)菌門序列總和占各組小鼠糞便菌群中序列總數(shù)99%以上。其中，擬桿菌門和厚壁菌門又是腸道菌群中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，這2個(gè)菌門豐度在正常對(duì)照組中約占95.75%，在清腸化濕方組中約占93.34%，在模型組中約占86.62%，模型組擬桿菌門和厚壁菌門豐度之和小于正常對(duì)照組和清腸化濕方組，但無顯著性差異。正常對(duì)照組中疣微菌門(0.000 66%)含量極少，模型組疣微菌門(4.071%)含量較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，上調(diào)6 000余倍；清腸化濕方組干預(yù)治療后疣微菌門豐度較模型組下調(diào)近一半(2.136%)，但與模型組比較無差異顯著性。與正常對(duì)照組中變形菌門豐度(2.090%)相比，模型組變形菌門豐度增加(6.845%)，清腸化濕方組干預(yù)治療后變形菌門豐度下降(2.749%)并且與正常對(duì)照組變形菌門豐度相似，但兩兩比較皆無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖6a、c)。

圖6b顯示的是在屬水平上豐度排序前50位(TOP50)的菌群Heatmap圖，展示了這些菌群在每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中的含量變化。圖6d～6e展示的是各組在TOP50菌群內(nèi)豐度有顯著變化的菌群。與正常對(duì)照組比較，模型組中顯著上調(diào)的菌屬有Akkermansia(P<0.01)、Candidatus_Stoquefichus(P<0.01)、Turicibacter(P<0.01)、Romboutsia(P<0.01)、Eubacterium_fissicatena_group(P<0.05)、Parasutterella(P<0.05)、Parabacteroides(P<0.05)、Faecalitalea(P<0.05)、Olsenella(P<0.05)、Erysipelatoclostridium(P<0.05)和Adlercreutzia(P<0.01)，下調(diào)的菌有Alistipes(P<0.01)、Ruminiclostridium(P<0.01)、Alloprevotella(P<0.01)、PrevotellaceaeNK3B31group(P<0.05)、Ruminococcaceae_uncultured(P<0.01)、Lachnospiraceae_uncultured(P<0.05)和Odoribacter(P<0.05)。在這些變化的菌群中，對(duì)于豐度上調(diào)的菌屬，清腸化濕方干預(yù)治療后的小鼠腸道中Akkermansia、Eubacterium_fissicatena_group、Turicibacter、Adlercreutzia、Romboutsia、Parasutterella、Parabacteroides、Erysipelatoclostridium、Faecalitalea、Olsenella這些菌屬的豐度呈較大下調(diào)趨勢(shì)(下調(diào)倍數(shù)≥1.4)，且下調(diào)后的Erysipelatoclostridium、Parabacteroides、Faecalitalea、Olsenella豐度與正常對(duì)照組相比無顯著性差異。對(duì)于在模型組中豐度顯著下調(diào)的菌屬Alistipes、Odoribacter、Ruminiclostridium、Ruminococcaceae_uncultured，清腸化濕方干預(yù)治療后，這些菌屬豐度呈較大上調(diào)趨勢(shì)(上調(diào)倍數(shù)≥1.3)，且上調(diào)后的Ruminiclostridium豐度與模型組相比顯著上調(diào)(P<0.05)，另外上調(diào)后的Odoribacter豐度與正常對(duì)照組相比無顯著性差異。由此可見，清腸化濕方干預(yù)治療能夠不同程度地逆轉(zhuǎn)模型組小鼠腸道內(nèi)的菌群失衡并向正常組菌群趨近。

3 討論

丁酸作為腸道內(nèi)厭氧細(xì)菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物之一，對(duì)結(jié)腸功能的正常發(fā)揮具有重要的作用。與健康個(gè)體相比，UC患者的腸黏膜丁酸鹽攝取和利用受到抑制[5]。重度UC患者糞便中丁酸、異丁酸濃度下降[6]，采用丁酸治療UC患者可使其臨床癥狀和組織學(xué)病理得到改善[7]。丁酸作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的重要能量來源[8]，可以增強(qiáng)腸道黏膜屏障，加強(qiáng)細(xì)胞緊密連接[9]，下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)[10]等。強(qiáng)效促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α能夠介導(dǎo)持續(xù)性的IBD炎癥導(dǎo)致組織破壞[11]，TNF-α亦會(huì)降低丁酸氧化導(dǎo)致結(jié)腸細(xì)胞能量供應(yīng)減少[12]。本研究結(jié)果顯示清腸化濕方治療后的小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6含量顯著下調(diào)，說明清腸化濕方減輕腸道炎癥與下調(diào)促炎因子有關(guān)。清腸化濕方治療后，小鼠腸道內(nèi)丁酸含量較模型組顯著升高，上調(diào)的丁酸可以進(jìn)一步下調(diào)促炎因子水平，從而減緩腸炎進(jìn)展。

腸道菌群被認(rèn)為是UC發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵因素[13]，UC與腸道菌群失衡和微生物多樣性降低有關(guān)[14]。本研究中，模型組小鼠的腸道菌群多樣性亦表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，一些菌群的組成及豐度也發(fā)生了改變。在門水平，模型組小鼠疣微菌門豐度顯著增加，這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。DSS誘導(dǎo)腸炎模型動(dòng)物中Akkermansia[16]、Erysipelatoclostridium[13]、Turicibacter[17]、Faecalitalea[18]、Parasutterella[19]和Parabacteroides[17]的豐度增加。Parasutterella和Parabacteroides被認(rèn)為是潛在有害菌群，與炎癥性腸病呈正相關(guān)[19]。Parabacteroides豐度與結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin、ZO-1基因表達(dá)水平負(fù)相關(guān)[20]。在TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠模型中，侵襲性細(xì)菌如Escherichia-Shigella、Akkermansia、Turicibacter與結(jié)腸促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等呈正相關(guān)[21]。

注：a，c.各組在菌門水平的豐度;b.各組在TOP50菌屬的豐度; d，e.TOP50菌屬內(nèi)豐度有顯著變化的菌群;C1～C6.正常對(duì)照組; M1～M6.模型組;L1～L6.清腸化濕方組。Control.正常對(duì)照組; DSS.模型組;QCHS.清腸化濕方組。

Alistipes主要存在于健康人類的腸道中，其存在與促進(jìn)健康表型有關(guān)，在結(jié)腸炎疾病中具有保護(hù)作用，能夠產(chǎn)生具有抗炎性質(zhì)的短鏈脂肪酸[22]。Alloprevotella[23]、Odoribacter[24]、Ruminococcaceae和Lachnospiraceae[25]都能夠產(chǎn)生丁酸。Alloprevotella、PrevotellaceaeNK3B31group屬于抗炎細(xì)菌[26]。Odoribacter增加可能有助于減輕炎癥[24]。DSS誘導(dǎo)腸炎小鼠糞便中Alloprevotella豐度與IL-6和TNF-α負(fù)相關(guān)而與抗炎因子IL-10水平正相關(guān)[27]。DSS誘導(dǎo)腸炎大鼠糞便中Prevotellaceae_NK3B31_group顯著降低并推測(cè)此降低與炎癥相關(guān)[18]。Ruminococcaceae具有抗炎活性，在宿主健康中可能發(fā)揮潛在的生理功能[28]。Lachnospiraceae能夠維持胃腸道健康，并成為評(píng)估腸道健康的有力工具[21]。UC患者糞便中Lachnospiraceae豐度顯著降低，人體腸道菌群模型中丁酸產(chǎn)量下降與Lachnospiraceae豐度下降有關(guān)[29]。本研究中模型組小鼠腸道內(nèi)丁酸含量降低和炎癥增加，亦可能與這些產(chǎn)生丁酸或抗炎相關(guān)菌群的數(shù)量下降有關(guān)。

清腸化濕方能夠下調(diào)模型組小鼠腸道內(nèi)疣微菌門、變形菌門豐度，使模型組小鼠腸道內(nèi)豐度顯著上調(diào)的菌屬Akkermansia、Eubacterium_fissicatena_group、Turicibacter、Adlercreutzia、Romboutsia、Parasutterella、Parabacteroides、Erysipelatoclostridium、Faecalitalea、Olsenella含量呈較大降低趨勢(shì)，且下調(diào)后的Erysipelatoclostridium、Parabacteroides、Faecalitalea、Olsenella豐度與正常對(duì)照組相比無顯著性差異。對(duì)于在DSS模型組中豐度顯著下調(diào)的菌屬Alistipes、Odoribacter、Ruminiclostridium和Ruminococcaceae_uncultured，清腸化濕方可以使這些菌屬豐度增加，其中Ruminiclostridium較模型組顯著上調(diào)，Odoribacter豐度增加后與正常對(duì)照組相比沒有顯著性差異。因此，清腸化濕方能不同程度回調(diào)DSS造模小鼠腸道內(nèi)失調(diào)的大部分菌群，雖然未能使腸道菌群恢復(fù)至正常狀態(tài)，但逆轉(zhuǎn)了失調(diào)的大部分菌群變化趨勢(shì)，使得變化的菌群不同程度地向正常組水平趨近恢復(fù)。這也從腸道菌群角度，說明清腸化濕方干預(yù)治療DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠后可以改善腸道菌群生態(tài)平衡，降低促疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)菌群豐度，增加產(chǎn)丁酸或抗炎等有益疾病恢復(fù)的菌群豐度。

綜上所述，通過DSS誘導(dǎo)制備的小鼠UC模型，本研究展示了清腸化濕方對(duì)UC模型小鼠良好的治療作用，表現(xiàn)為可以增加疾病小鼠體質(zhì)量、減輕脾臟腫大、降低結(jié)腸病理?yè)p傷、增加結(jié)腸長(zhǎng)度等。通過結(jié)腸組織中促炎因子IL-6、TNF-α和丁酸、異丁酸含量檢測(cè)，結(jié)合糞便菌群測(cè)序分析，證明清腸化濕方緩解模型小鼠腸道炎癥機(jī)制與下調(diào)促炎因子水平、上調(diào)腸道內(nèi)丁酸和異丁酸含量、維持腸道菌群平衡有關(guān)。本研究完善了清腸化濕方治療UC的機(jī)制研究，從微生物及其代謝產(chǎn)物角度探討了清腸化濕方治療UC的作用機(jī)理，研究結(jié)果將為基于清腸化濕方的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。