張姍姍，彭宏威，鄒聰，劉南

·技術(shù)與方法·

底部預(yù)置二維碼凍存管在生物樣本存儲中的應(yīng)用方法

張姍姍，彭宏威，鄒聰，劉南

430071 武漢，湖北省人類遺傳資源保藏中心/武漢大學(xué)中南醫(yī)院生物樣本庫/武漢大學(xué)人類遺傳資源保藏中心

隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和健康醫(yī)療大數(shù)據(jù)快速成為醫(yī)學(xué)研究的熱點[1-3]，越來越多的研究者認識到人類遺傳資源與信息是醫(yī)學(xué)研究的寶貴資源，是精準醫(yī)學(xué)的基石[4]。醫(yī)學(xué)研究對生物樣本的收集、保存和應(yīng)用需求日益增加，高質(zhì)量大規(guī)模生物樣本庫的建立對探索人類疾病新治療途徑和提高科研效率極具幫助[5-6]。生物樣本庫一般使用凍存管儲存生物樣本，每個凍存管必須有明確的信息化標識。由于樣本待標注信息很多，傳統(tǒng)的手寫標記已經(jīng)無法滿足樣本庫大批量樣本的需求，使用條形碼標識成為必須。常用的條形碼有一維碼、二維碼和無線射頻識別。其中，二維碼有明顯優(yōu)勢，且底部預(yù)置的方式是大勢所趨。目前關(guān)于底部預(yù)置二維碼凍存管在樣本存儲過程中的應(yīng)用方法在各項操作指南和最佳實踐中均沒有詳細的說明，相關(guān)的文獻報道也很少[7-9]。本文就此應(yīng)用進行介紹，以期為綜合型樣本庫的初期運行提供參考。

1 凍存管的信息化標識

一維碼信息錄入速度快，具有校驗功能以防止錯讀，但其數(shù)據(jù)容量僅能達到 30 個字符左右，只能用數(shù)字、字母和符號在水平方向上表達信息，空間利用率較低且一旦發(fā)生污損將被拒讀。二維碼始于 20 世紀 80 年代末，比一維碼更高級，數(shù)據(jù)容量升級至 250 倍儲存量，能額外使用聲音、文字、圖形和指紋等在橫向和縱向同時表達信息，空間利用率高，成本低，易制作，持久耐用[10]。此外，它有強大的糾錯和加密功能，因穿孔、污損等引起局部損毀時，損毀面積達30% 仍可讀取完整信息，只是需要使用專用的圖像式閱讀器[11]。

鑒于二維碼的優(yōu)勢，早期大多數(shù)樣本庫通過對不同類型的樣本設(shè)置相應(yīng)的編碼規(guī)則進行樣本管理。如，郭愛華等[12]根據(jù)血液樣本編碼規(guī)則生成以下編碼SCMC2012KSCIN80245654LX2D3G1，表示上海兒童醫(yī)學(xué)中心 2012 年心內(nèi)科采集門診號為 80245654 患兒父親血漿第 3 管樣本。然后使用條碼打印機將編碼信息生成的標簽貼到凍存管上。這種方法屬于后印方式，可適用于多種材質(zhì)儲存容器（如聚丙烯管、聚碳酸酯管、玻璃管等），而且成本低廉，但存在以下缺點：編碼規(guī)則不一致且復(fù)雜冗長，需自行編碼、打印并粘貼，容易出現(xiàn)錯誤；存儲過程中存在標簽掉落的風險，造成樣本信息缺失甚至混亂；對于需要低溫冷凍的樣本，標簽還必須有良好的防凍性（如防液氮標簽），這提高了使用成本。為了優(yōu)化這些問題，底部預(yù)置二維碼凍存管（簡稱二維碼預(yù)置管）應(yīng)運而生。

底部預(yù)置二維碼是通過激光蝕刻在凍存管的底部，有以下優(yōu)勢：統(tǒng)一編碼，每支凍存管都有唯一編號；機械化嵌入底部，脫落可能性低；批量制作，成本低；可靈活適應(yīng)多種工作環(huán)境，量少時單支掃描人工操作，量多時整板掃碼匹配自動化設(shè)備進行批量分裝樣本，可以大幅度提高識別效率，縮短樣本出入庫時長[13]。然而二維碼預(yù)置管存在以下問題：預(yù)印碼沒有任何樣本相關(guān)信息，使用前需根據(jù)樣本處理的要求設(shè)置相應(yīng)規(guī)則以保證信息一一對應(yīng)，核對無誤后才能入庫；樣本出庫時無法直觀地進行樣本識別和查找，需結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配；在深低溫環(huán)境或環(huán)境溫度變化時，可能會引起底部條碼嚴重結(jié)霜，干擾識別準確度和效率[8]。針對這些問題，本文總結(jié)了二維碼預(yù)置管在血液、尿液及組織樣本的存儲過程中的應(yīng)用方法。

2 應(yīng)用舉例

2.1 血尿樣本的存儲

2.1.1 血尿樣本的采集及臨床信息對應(yīng) 樣本采集前需要制定研究方案確定保留成分、體積及數(shù)量，從而選擇采集容器的類型和規(guī)格[14]。常規(guī)采集的每例血液樣本為一支 2 ml 的 EDTA 抗凝全血，每例尿液樣本為一支 10 ml 的晨間中段尿。血液及尿液樣本采集后，在 4 h 內(nèi)完成交接、轉(zhuǎn)運和處理，樣本分裝至二維碼預(yù)置管后盡快入庫（圖 1）。

處理血尿樣本前，首先對樣本進行編號以便與臨床信息對應(yīng)[15]。樣本采集對象一般為獲知并簽署樣本捐贈知情同意書的住院患者，其入院信息可以從醫(yī)院信息系統(tǒng)（hospital information system，HIS）導(dǎo)出。每天將有樣本的病區(qū)的入院信息導(dǎo)出，按入院時間降序排序后提取前一天信息合并至入院信息總表，查找住院號或姓名分別對血尿樣本自然編號，將已編號的樣本信息提取至當日信息表。在入院信息總表中，血尿樣本均采集后可刪除整行，其余編號全部改為√。未取樣的入院信息保留 2 個月，若有重復(fù)入院，保留最新一次。

2.1.2 血液樣本處理及其凍存管的編號、掃碼、使用和信息對應(yīng) 血樣離心條件：4 ℃，2500 ×，10 min。2 ml 血樣分層后分裝 3 管 250 μl 上層血漿和 3 管 120 μl 中間白膜層（先留取 500 μl 至中間管，充分混勻再分裝）。凍存管選用 0.5 ml 二維碼預(yù)置管，每盒 96 管。若血樣體積不足 2 ml，每種成分盡量保證第 1 管體積。不足 6 管的，仍按 6 管分裝，空管體積為 0 μl。批量成分分裝由自動化液體工作站完成，其余血樣按同樣規(guī)則手動處理。

圖 1 底部預(yù)置二維碼凍存管在樣本全流程中的應(yīng)用和信息對應(yīng)

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分裝血樣的空凍存管根據(jù)需求整盒編號、掃碼并放入–20 ℃冰箱預(yù)冷待用。自動化液體工作站使用的凍存管無需提前掃碼，為方便使用，在盒蓋正前方左側(cè)用凍存盒側(cè)面一維碼后兩位進行自然編號，如 LVL100043351，記為 51（整箱連號使用，圖 2A）。手動處理的凍存管則需要用整板掃碼儀提前掃碼。盒蓋自然編號左邊加上“手”字，標記此盒為手動處理用（圖 2A）。將掃碼表命名為 S-盒子一維碼后五位，如 S-43351。

每例樣本的 3 管血漿和 3 管白膜層分別放入 P①~ ③和 Bc④~ ⑥（圖 2B），–80 ℃冰箱暫存，滿盒后入庫至 3 個氣相液氮罐。每個液氮罐有 6 個分區(qū)，分別可放8 ~ 14 個凍存架，每個凍存架有 15 層，每層可放一個 2 英寸的 10 × 10 凍存盒，從下往上依次使用。凍存盒位置編號的規(guī)則如下：N02-02-06-05，表示 2 號液氮罐 2 區(qū)第 6 架從下往上第 5 層。每個凍存架滿 5 盒后啟用下一架。如 N02-02-06-05 入庫后啟用 N02-02-07-01。

當日處理完血樣，在血樣存儲位置表錄入每一管樣本的臨床信息、處理過程及凍存管號。分裝后暫存于–80 ℃的血樣，每滿 6 盒掃碼入庫。掃碼前充分除霜以保證 96 孔都完成識別。為避免樣本凍融，此過程越快越好。目前效果較好的除霜方法如下：先用布擦除大部分表面的霜，再噴灑少量純酒精到凍存管底部可使二維碼完全顯示（經(jīng)過試驗，凍存管浸泡在純酒精 3 天后，底部二維碼仍可完全識別，沒有任何損害），若仍有少量冰渣，再用布擦拭除冰后即可掃碼。掃碼表命名為位置編號+ 盒子一維碼后5 位，如 1435(N01-04-03-05)-43272。將掃碼表和血樣存儲位置表中的凍存管號核對，確保分裝正確。核對無誤后，將樣本按位置編號放入液氮罐并錄入每管樣本的位置信息和入庫信息。

2.1.3 尿液樣本處理及其凍存管的編號、掃碼、使用和信息對應(yīng) 尿樣離心條件：常溫，4000 r/min，10 min。10 ml 尿樣分層后手動分裝 4 管 1.5 ml 尿上清和 3 管 1 ml 尿沉渣（棄多余上清，留 3 ml 含沉渣的液體，充分混勻再分裝）。凍存管選用 1.5 ml 二維碼預(yù)置管（IBIO-GENE IBG-V9151，管側(cè)有數(shù)字編碼）。若尿樣 < 9 ml，調(diào)整各成分數(shù)量體積并記錄。若尿樣< 3 ml，為不合格樣本，需重新采集樣本。

每例尿樣分裝后，按順序放入已編號的 10 × 10 凍存盒，未裝滿時放入–80 ℃冰箱暫存，滿盒后根據(jù)位置編號入庫至–80 ℃超低溫水冷冰箱。每臺冰箱有三層，每層可放 4 個凍存架，每個凍存架有 6 行，每行可放 5 個 2 英寸的 10 × 10 凍存盒，每層共 120 盒。將 6 行從上到下依次編號為 A、B、C、D、E、F，每行從里到外編號為 1、2、3、4、5 列。如，R04-02-03-A2 表示 4 號冰箱第 2 層第3 架第 1 行第 2 列。為方便使用，在盒子一維碼右邊和盒蓋右下角按順序?qū)懽匀恍蛱?1-120，依次對應(yīng)每層的位置編號（寫在盒子一維碼左邊和盒蓋上，圖 3A）。

分裝尿液的凍存管，每盒裝滿 100 支，整盒編號后掃碼。打開掃碼軟件 ScanDM 10 × 10，盒子一維碼側(cè)朝外，右上角對齊設(shè)備 Epson Perfection V600 Photo 掃描區(qū)右上角。掃碼后，顯示圖會閃爍一次并將成功掃描的凍存管圈出來（圖3B），確保全部掃描成功。掃碼表命名為 1-120，保存至每層相應(yīng)文件夾并將一維碼錄入統(tǒng)計表。當日處理完尿樣，在尿樣存儲位置表中錄入每一管樣本的臨床信息、處理過程、凍存管號及存儲位置。

2.2 組織樣本的存儲

2.2.1 組織樣本的采集及臨床信息對應(yīng) 取樣員從 HIS 導(dǎo)出當日需取樣本的手術(shù)信息，在手術(shù)室隨時注意手術(shù)進展動態(tài)，記錄樣本熱缺血及冷缺血時間等。樣本交接后盡快4 ℃轉(zhuǎn)運至病理科取材室。

2.2.2 組織樣本的處理及其凍存管的編號、掃碼、使用和信息對應(yīng) 取樣員對標本拍照后由病理醫(yī)生按照正常組織（如有）、癌旁組織、癌組織依次取材。取樣員使用無菌器械切分標本約 0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm大小。切分后的新鮮組織一半放入 0.5 ml 二維碼預(yù)置管（IBIO-GENE IBG-V1052，管側(cè)有數(shù)字編碼），迅速轉(zhuǎn)入暫存液氮罐；另一半放入加了 1 ml 的 RNAlater 溶液的 1.5 ml 二維碼預(yù)置管（IBIO-GENE IBG-V1150，管側(cè)有數(shù)字編碼），4 ℃過夜充分浸潤組織，盡可能地棄上清后入庫至液氮罐[16]。組織取材使用的二維碼預(yù)置管已提前整盒掃碼并在管蓋和管側(cè)對應(yīng)寫上自然編號，取樣時按順序取用，對應(yīng)登記樣本信息。若因樣本過小等問題導(dǎo)致無法取到相應(yīng)樣本，則凍存管不會被使用，可用于留取下一例樣本。處理完組織樣本，在組織存儲位置表中錄入每一管樣本的基本信息、處理過程及凍存管號。

組織樣本的收集時間較分散，雖然使用的凍存管不僅底部有二維碼，管側(cè)有一維碼及數(shù)字編碼，但是一般至少有8 位數(shù)字且編碼不連續(xù)，在組織樣本分裝時不易肉眼識別。為優(yōu)化此問題，每盒裝滿 100 支后，在每支管的管蓋上方和管側(cè)空白處用防液氮記號筆寫自然編號 1 ~ 100（10 ×10 盒缺角處從左往右，從上往下）。其中，為了避免管蓋上 6 和 9 等序號顛倒后混淆，將包含 6 的 1 行和 1 列數(shù)字、18 和 81 下方均加下劃線（圖 4）。使用時注意管蓋和管子一一對應(yīng)，避免樣本信息錯亂。編號后整盒掃碼，掃碼表命名為備用盒自然序號+ 凍存管規(guī)格+ 盒子一維碼+ 科室+ 領(lǐng)用日期+ 用完日期，如，備 1 紅 1.5-B065659骨科領(lǐng)用 190415-190523。使用完的空盒回收再用，已用完的掃碼表移入已用完凍存盒文件夾中。

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圖 4 底部預(yù)置二維碼凍存管分裝組織樣本的自然編號規(guī)則

暫存罐中新鮮凍存的組織每周入庫一次，分配至 3 個氣相液氮罐。同一樣本的復(fù)份數(shù)除以 3，整數(shù)為每個罐子至少分配的量，余數(shù)根據(jù)實際空間均勻分配。（如，1 號樣本有 7 支，51 ~ 57 號，則 51 ~ 53 入 N07，54 ~ 55 入 N08，56 ~ 57 入N09）。位置分配可提前算好列出來，盡可能縮短分裝時間。組織數(shù)量較多時，可先分裝到 3 個中轉(zhuǎn)低溫凍存盒，再轉(zhuǎn)移入液氮罐的相應(yīng)凍存盒，拍照后錄入樣本位置。當組織樣本滿盒時，不采取整盒掃碼核對，而是將管蓋上的自然編號拍照后核對位置信息，以縮短樣本在室溫中暴露的時間，盡量避免樣本凍融。

2.3 二維碼預(yù)置管樣本的出庫流程

二維碼預(yù)置管樣本的出庫需要結(jié)合完善的入庫信息表。首先根據(jù)出庫申請查詢樣本存儲情況，將符合條件的樣本標記為預(yù)出庫。申請得到批準后，篩選必要信息生成預(yù)出庫單，其中位置信息包括：凍存盒及凍存管位置、凍存管二維碼、管號（自然編號，適用于組織樣本）。將位置信息排序，方便快速取出凍存管。根據(jù)打印好的預(yù)出庫單依次快速取出樣本，按順序放入預(yù)冷凍的空凍存盒。為了盡可能減少樣本凍融的風險，整個過程在冰板上完成，控制在 15 min 左右，否則分批出庫。將取出的樣本快速底部除霜掃碼后暫存至–80 ℃冰箱。將實際出庫掃碼與預(yù)出庫單上的二維碼信息通過 if 函數(shù)快速核對。若有不一致，分析并找出原因，如原始信息表錄入有誤、出庫時拿錯位置等。若核對有誤，決定不出庫時，將樣本歸回原位并標記清楚。樣本出庫的準確度依賴于入庫信息的準確度，因此入庫信息需定期核對，盡可能地避免信息錄入錯誤導(dǎo)致樣本無法識別。

3 小結(jié)

生物樣本庫中使用的凍存管容積較小，大多為 0.3 ~2 ml，標簽可用空間有限。在凍存管底部設(shè)置二維碼充分體現(xiàn)了二維碼可以根據(jù)空間調(diào)節(jié)大小的優(yōu)勢。此外，底部預(yù)置結(jié)合整板掃碼可以提高識別效率，促進樣本的快速出入庫，也能匹配自動化設(shè)備。因此，底部預(yù)置二維碼凍存管是目前在樣本庫中應(yīng)用最廣泛的存儲容器。然而預(yù)置二維碼與樣本信息沒有關(guān)聯(lián)且不能肉眼識別，如何提高使用效率及準確率是實際應(yīng)用過程中需要不斷克服的難題。

二維碼預(yù)置管的使用核心在于樣本信息的整合。本研究中涉及的樣本主要來源于醫(yī)院的臨床樣本，包括血液、尿液及組織。首先通過醫(yī)院信息系統(tǒng)和實驗室信息系統(tǒng)有效抓取正確的樣本來源信息及相關(guān)檢測結(jié)果，有助于后期的跟進隨訪。其次，樣本自收集到出庫使用的整個生命周期的全流程管理非常重要。樣本的存儲最終以投入使用為目的，因此針對不同項目的樣本需要設(shè)計合理高效的預(yù)處理、分裝、入庫及出庫流程，每個過程都涉及到凍存管的信息識別。最后，有必要定期核檢已入庫的樣本的凍存管信息與存儲位置是否對應(yīng)。本研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，預(yù)置二維碼的前提下，若規(guī)格允許（≥ 0.5 ml），批量生產(chǎn)時可以在管側(cè)增加數(shù)字編碼，增強實際操作中的肉眼識別度。尤其是信息核對有誤時，自然編號的使用在組織樣本存儲過程中進一步增強了凍存管肉眼識別度，從而提高了使用正確率，也為樣本的出庫提供了便捷，縮短出庫時間，減少樣本凍融風險。另外，開發(fā)成熟的樣本庫管理系統(tǒng)來匹配自動化處理及存儲設(shè)備，可進一步體現(xiàn)二維碼預(yù)置管整板掃碼的優(yōu)勢，同時也能很好地解決信息對應(yīng)的問題。

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湖北省衛(wèi)生健康委員會聯(lián)合基金（WJ2019H080）

劉南，Email：liunan427@126.com

2020-08-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.013