王莎莎付 瑞王 吉岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 102629)

鼠痘病毒(ectromelia virus,ECTV)是一類有囊膜,基因組為180 ～200 kb 大小的線性雙股DNA 病毒,是動(dòng)物病毒中體積大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的DNA 病毒,病毒粒子呈卵圓形或磚形,大小為230 nm×170 nm,在分類上屬于痘病毒科,脊索動(dòng)物痘病毒亞科,正痘病毒屬。 ECTV 的自然宿主為小鼠,1930 年首次在英國(guó)的實(shí)驗(yàn)小鼠種群中分離,隨后在墨西哥、日本、美國(guó)、中國(guó)均有發(fā)現(xiàn)[1]。 ECTV 多呈爆發(fā)性流行,致死率較高,常造成全群淘汰,危害極大。 不同宿主的易感性不同,臨床上急性感染小鼠以四肢、尾和頭部腫脹、潰爛、壞死甚至腳趾脫落為特征,故又稱脫腳病,而隱性帶毒鼠通常沒(méi)有明顯癥狀,為實(shí)驗(yàn)小鼠種群的重大安全隱患。 實(shí)驗(yàn)室常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)ECTV 抗體進(jìn)行日常監(jiān)測(cè),而隱性帶毒鼠的血清抗體水平較低,血清學(xué)檢測(cè)方法有可能造成假陰性[2],且感染動(dòng)物的病毒抗體的產(chǎn)生存在空窗期,因此,對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的ECTV 核酸篩查在感染初期非常重要。 本研究建立了ECTV 特異靈敏的TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)檢測(cè)方法,能夠?qū)崿F(xiàn)快速批量檢測(cè),且首次在黃鼠組織中檢測(cè)到ECTV 核酸,提示在使用實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物時(shí)還需重視ECTV 的感染情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

22 只6 周齡雄性(18～22 g)清潔級(jí)小鼠來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)室[SCXK(京)2017-0005],[SYXK(京)2017-0013],63 只14～34 月齡屏障環(huán)境飼養(yǎng)裸鼴鼠,重22g ～42g, 其中雌性31 只,雄性32 只,由海軍軍醫(yī)大學(xué)提供[SCXK(滬)2017-0002]。 動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(滬)2017-0004]。 由中國(guó)食品藥品檢定研究院審批通過(guò)(中檢動(dòng)(福)第2019(A)001 號(hào)),所有動(dòng)物均按3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣品與毒種

鼠痘病毒(ectromelia virus,ECTV)、牛痘病毒(vaccinia virus, VACV )、 鼠 腺 病 毒 ( murine adenovirus, MAdV)、 小 鼠 多 瘤 病 毒( murine polyomavirus ,Poly)、小鼠微小病毒(minute virus of mice,MVM)為本室保存；63 份裸鼴鼠脾組織樣本(編號(hào)為NP1～NP63 號(hào))來(lái)自中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)；22 只清潔級(jí)小鼠脾組織(編號(hào)為MS1 ～MS22)和4 只黃鼠的20 份組織樣本為本實(shí)驗(yàn)室送檢樣品,來(lái)自于國(guó)內(nèi)4 個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用單位,其中黃鼠的組織包括肝組織(編號(hào)為SQLi1 ～SQLi4)、脾組織(編號(hào)為SQS1 ～SQS4)、腎組織(編號(hào)為SQK1 ～SQK4)、肺組織(編號(hào)為SQLu1 ～SQLu4)、淋巴組織(編號(hào)為SQLy1～SQLy4)。

1.2 主要試劑與儀器

DNA 快速提取試劑盒品牌為QIAGEN；普通PCR 系列試劑及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TaqMan Gene Expression Master Mix 品牌為ABI。 PCR 儀和核酸瓊脂糖凝膠電泳儀品牌為為美國(guó)Bio-RAD；凝膠成像分析儀品牌為為美國(guó)Kodak；熒光定量PCR 儀7500fast Real-Time PCR System 品牌為美國(guó)ABI。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

比對(duì)NCBI 上現(xiàn)有的ECTV 基因序列,選擇同源性最高的crmD基因(NCBI ID：KJ563295)保守區(qū)域,設(shè)計(jì)FQ-PCR 的引物探針,序列如表1 示。

1.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

合成ECTV 基因crmD序列包含引物探針的部分,轉(zhuǎn)入pMD19-T 質(zhì)粒中,作為ECTV FQ-PCR 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-ECTV,濃度為1.0×109copies/μL。

1.3.3 病毒DNA 的獲取

對(duì)正常BHK21 細(xì)胞、BHK21 細(xì)胞培養(yǎng)的ECTV毒株和VACV、MAdV、Poly、MVM 病毒培養(yǎng)液,以及63 份裸鼴鼠脾組織樣本和22 份小鼠脾組織樣本、4只黃鼠的肝、脾、腎、肺、淋巴結(jié)等20 份組織樣本按照DNA 快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行DNA 提取。提取的DNA 凍存于-30℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 ECTV FQ-PCR 擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)條件優(yōu)化, FQ-PCR 的最佳反應(yīng)體系為引物探針混合物(10 μmol/L)1 μL,模板1 μL,加入TaqMan Gene Expression Master Mix 以及無(wú)RNase 水使總反應(yīng)體積達(dá)到20 μL。 使用熒光定量PCR 儀7500fast Real-time PCR System 設(shè)定程序50℃預(yù)熱2 min；95℃預(yù)變性10 min；擴(kuò)增循環(huán)為95℃ 15 s,60℃1 min,共40 個(gè)循環(huán),在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。

將pMD19-ECTV 作為標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行10 倍系列稀釋為1.0×109～1.0×100copies/μL,作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng),選取線性較好6 個(gè)稀釋度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 ECTV FQ-PCR 檢測(cè)方法的特異性、靈敏性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)

表1 用于擴(kuò)增crmD 基因的引物與TaqMan 探針序列Table 1 Pimers and TaqMan probes sequences for the crmD gene amplification

使用建立的FQ-PCR 方法檢測(cè)ECTV、VACV、MAdV、Poly、MVM 病毒核酸,并設(shè)立BHK21 細(xì)胞核酸和無(wú)RNase 水作為陰性對(duì)照(N/C)檢測(cè)ECTV FQ-PCR 方法的特異性。 檢測(cè)1.0×109～1.0×100copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行,檢測(cè)方法的靈敏性。 使用建立的FQ-PCR 方法對(duì)3 份陽(yáng)性樣品進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

1.3.6 ECTV FQ-PCR 在不同樣品中的應(yīng)用

使用建立的ECTV FQ-PCR 方法對(duì)1.3.3 中獲取的不同的樣本DNA 進(jìn)行ECTV 篩查,并對(duì)陽(yáng)性樣本使用普通PCR 引物crmD1 ∶5'-CTGCGAATTT GAAGGATC-3 '； crmD2： 5 '-CGTCGTGGGTGTTAG TTG -3'進(jìn)行擴(kuò)增[3],擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 ECTV FQ-PCR 擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-ECTV 稀釋度為1.0×108～1.0×103copies/μL 的檢測(cè)結(jié)果制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示,其相關(guān)系數(shù)Slope 為-3.487、相關(guān)系數(shù)R2值為0.998,擴(kuò)增效率Eff%為93.544%(90%～110%之間)。

2.2 ECTV FQ-PCR 特異性檢測(cè)

如圖2 所示, 建立的ECTV FQ-PCR 檢測(cè)VACV、MAdV、Poly、MVM 病毒核酸以及BHK21 細(xì)胞核酸和無(wú)RNase 水均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線,而對(duì)ECTV 病毒DNA 有S 型擴(kuò)增曲線,CT 值為12.29,說(shuō)明建立的方法有很好的特異性。

2.3 ECTV FQ-PCR 靈敏性檢測(cè)

對(duì)1.0×109～1.0×100copies/μL 稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-ECTV 進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)稀釋度三個(gè)平行,所能檢測(cè)的最小濃度梯度的循環(huán)閾值(CT)≤35,拷貝數(shù)(Copies)≥10 時(shí)FQ-PCR 結(jié)果可信,結(jié)果如圖3,顯示標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為10 copies/μL 時(shí)CT 值為33.09,三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均有擴(kuò)增曲線,測(cè)得拷貝數(shù)為30.90 copies,在可信范圍之內(nèi),而濃度為1 copies/μL 時(shí)CT 值為36.01,測(cè)得的拷貝數(shù)為4.5 copies,但在三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)中,僅有一個(gè)實(shí)驗(yàn)有數(shù)據(jù),說(shuō)明已超出檢測(cè)限。 因此確定該方法的靈敏度為10 copies。

2.4 ECTV FQ-PCR 準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)

圖1 ECTV FQ-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Note.Target, Target 1 Slope, -3.487.Y-lnter,38.291.R2,0.998.Eff%,93.544%.Figure 1 ECTV FQ-PCR standard curve

圖2 ECTV FQ-PCR 特異性檢測(cè)結(jié)果Note.1, ECTV.2-7, VACV/MAdV/Poly/MVM/BHK21 cell/RNase free water.Figure 2 ECTV FQ-PCR specificity test

圖3 ECTV FQ-PCR 靈敏度檢測(cè)擴(kuò)增曲線Figure 3 ECTV FQ-PCR sensitivity test amplification curves

使用 濃 度 分 別 為1 × 106copies/μL、1 × 105copies/μL、1×104copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè),且進(jìn)行三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),最終實(shí)測(cè)值的均值分別為1.2×106copies/μL、1.078×105copies/μL、1.33×104copies/μL,計(jì)算CTSD 值及CV 值如表2。3 個(gè)濃度梯度3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct 值的變異系數(shù)(CV)均小于5%,表明方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

2.5 ECTV FQ-PCR 在鼠組織樣品中的應(yīng)用

對(duì)收集到的動(dòng)物組織樣本進(jìn)行ECTV 篩查,結(jié)果如表3、圖4 所示,顯示在黃鼠的肝、脾、腎、肺、淋巴組織中均檢測(cè)到ECTV 陽(yáng)性,陽(yáng)性樣品中ECTV的核酸拷貝量均較低,其中濃度最高的是黃鼠淋巴組織SQLy1,達(dá)106.967 copies/μL,且淋巴組織的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。 對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR 后測(cè)序,顯示其與ECTV 核酸的同源性為99%,進(jìn)一步驗(yàn)證了檢測(cè)的黃鼠感染了ECTV。 而在實(shí)驗(yàn)室裸鼴鼠組織和小鼠組織ECTV 篩查結(jié)果顯示均為陰性。

3 討論

鼠痘病毒作為我國(guó)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)及檢測(cè)》(GB14922.2-2011)中規(guī)定的清潔級(jí)及以上級(jí)別小鼠的必檢項(xiàng)目[4],我國(guó)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了較為嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理及衛(wèi)生防疫制度,對(duì)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室中的鼠痘病毒的流行情況進(jìn)行了很好的控制。 現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠痘病毒的檢測(cè)方法為血清學(xué)方法,包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、免疫酶試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、免疫酶組織化學(xué)法,通常情況下,實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)1983 年至2011 年間的7 篇關(guān)于ECTV 的報(bào)道,僅有兩篇報(bào)道檢出ECTV 陽(yáng)性,且陽(yáng)性率很低[5]。 近些年已經(jīng)很少有關(guān)于ECTV 陽(yáng)性的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)室2017 至2019 年間使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)小鼠血清中的ECTV 抗體,未檢出陽(yáng)性,本實(shí)驗(yàn)使用的小鼠、裸鼴鼠、黃鼠分別使用小鼠、裸鼴鼠、大鼠的鼠痘病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)為鼠痘抗體陰性。 由于分子學(xué)方法直接檢測(cè)抗原,且彌補(bǔ)了血清學(xué)檢測(cè)方法在感染空窗期檢測(cè)造成的假陰性,具有很好的應(yīng)用前景。

為了全面的評(píng)價(jià)ECTV 對(duì)實(shí)驗(yàn)室小鼠的感染威脅,本研究擬建立ECTV FQ-PCR 對(duì)裸鼴鼠、黃鼠、小鼠組織進(jìn)行篩查。 選取了位于ECTV 核酸兩端的重復(fù)序列中的CrmD基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物探針,建立的ECTV Q-PCR 能夠靈敏特異的檢測(cè)ECTV 核酸,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)Slope 為-3.487、相關(guān) 系數(shù) R2值 為 0.998, 擴(kuò) 增 效 率 Eff% 為93.544%,最低能檢測(cè)到濃度為10copies 的樣品。

表2 熒光定量PCR 檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability and stability testing results of Q-PCR

表3 黃鼠組織樣本ECTV 檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of ECTV detection for ground squirrel tissue samples

圖4 黃鼠組織ECTV FQ-PCR 檢測(cè)的擴(kuò)增曲線Figure 4 The amplification curve of ground squirrel tissue samples for ECTV FQ-PCR test

近些年關(guān)于ECTV 的分子學(xué)診斷方法得到了廣泛關(guān)注,分別針對(duì)ERPV_027 基因[6]、核心蛋白P4b基因[7]設(shè)計(jì)了熒光定量PCR 方法,針對(duì)CrmD基因建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測(cè)方法[2]。 本研究針對(duì)CrmD基因建立FQ-PCR 方法,CrmD基因位于ECTV 的兩端重復(fù)序列中,相當(dāng)于一個(gè)病毒粒子中含有2 個(gè)拷貝的基因,且CrmD基因與病毒繁殖方式有關(guān)[8],在感染組織中核酸峰度較高,進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度。 TaqMan 熒光定量PCR 方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便易于高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),具有較高的適用性。

使用建立的ECTV FQ-PCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室22 份小鼠組織,未檢測(cè)出陽(yáng)性,說(shuō)明國(guó)內(nèi)屏障系統(tǒng)小鼠ECTV 的感染得到了很好的監(jiān)測(cè)和控制。 檢測(cè)63份裸鼴鼠組織ECTV 結(jié)果為陰性,說(shuō)明裸鼴鼠對(duì)ECTV 敏感性較低,但裸鼴鼠對(duì)ECTV 是否具有抗病毒作用還需要進(jìn)一步的研究分析。 20 份黃鼠組織檢測(cè)出ECTV 陽(yáng)性,說(shuō)明黃鼠為ECTV 的易感宿主。 小鼠感染ECTV 時(shí),首先通過(guò)皮下感染位點(diǎn)擴(kuò)散至淋巴結(jié),侵入血液后引發(fā)一級(jí)病毒血癥使病毒進(jìn)入脾和肝[8]。 本研究在4 只黃鼠的淋巴結(jié)均檢測(cè)到ECTV,而在肝、脾、腎、肺組織僅有部分檢測(cè)出病毒,說(shuō)明ECTV 在黃鼠體內(nèi)有與小鼠相似的感染途徑。 使用ECTV FQ-PCR 黃鼠組織的檢出率為50%,但病毒的拷貝數(shù)都比較低,而使用血清學(xué)方法未檢出黃鼠鼠痘抗體陽(yáng)性可能是由于此時(shí)正處于感染初期,為鼠痘抗體產(chǎn)生的空窗期,因此造成假陰性,也可能是由于使用大鼠的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)與黃鼠中鼠痘抗體沒(méi)有交叉反應(yīng),造成陰性結(jié)果。黃鼠主要分布于我國(guó)北部和西部地區(qū),由于其特有的生物學(xué)特性,已被大量用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)和冬眠生理學(xué)的實(shí)驗(yàn)材料,神經(jīng)生物學(xué)工作者也開(kāi)始使用黃鼠作為研究對(duì)象[9-10],也應(yīng)用于病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[11]。 但是黃鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究還存在很多空白,微生物攜帶情況及致病性研究為黃鼠飼養(yǎng)規(guī)范提供技術(shù)支持,有效促進(jìn)黃鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)程。 同時(shí),黃鼠感染ECTV 提示其作為新興實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物使用時(shí),需要避免其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的污染,以免引起ECTV 在實(shí)驗(yàn)室小鼠的爆發(fā)。