賈夢真黃巖杰楊曉青韓紅艷張建江

(1.河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科,鄭州 450099；3.河南中醫(yī)藥大學,鄭州 450046； 4.鄭州大學第一附屬醫(yī)院兒科,鄭州 450052)

膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)分子量為36×103,含有三個不同的功能區(qū)域：N 端區(qū)域,C 端區(qū)域和核心區(qū)域[1]。 核心區(qū)域由四個重復的氨基酸序列組成,它們緊密堆積形成一個具有凹面和凸面的彎曲結構,凸面含有膜結合必需的鈣和磷脂結合位點,N 端結構域位于核心結構的凹面,含有組織型纖溶酶原激活劑(tPA)和p11(S100A10 的片段)結合位點,C 端區(qū)域包含F-肌動蛋白,肝素和纖溶酶原結合位點[1-2]。 ANXA2 廣泛分布于各種真核細胞的細胞膜、細胞質和細胞核,參與膜轉運及膜表面一系列與鈣調蛋白相關的活動,包括增殖、分化、凋亡、遷移、膜修復和炎癥反應等多種細胞進程[3]。人ANXA2 是最早實現克隆的ANX 家族成員之一,在人類疾病學方面研究最廣泛[4]。 既往報道ANXA2 在多種腫瘤中過表達,參與癌癥的發(fā)生發(fā)展,涉及多種機制,并與預后不良密切相關[5]。 我們先前研究顯示ANXA2 在參與腎小球細胞性新月體形成的上皮細胞中高表達,在伴有新月體病變的紫癜性腎炎患兒尿中的濃度也明顯增高,拓展了對ANXA2 病理作用的認識[6]。 本文通過綜述運用基因調控技術敲低、敲除和過表達ANXA2 的相關研究,以期更全面地總結ANXA2 的病理作用及其相關作用機制,并精準探尋可能的臨床診療靶點。

1 基因調控技術在研究ANXA2 功能中的應用

近年來,基因調控技術廣泛應用于ANXA2 功能研究。 基因敲除或敲低的技術包括siRNA(smallinterfering RNA)技術、shRNA(short hairpin RNA)技術和成簇規(guī)律間隔短回文重復序列相關蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats ( CRISPR )/CRISPR-associated ( Cas ) 9,CRISPR/Cas9)技術。 因ANXA2 在多種疾病中過表達,有關探究ANXA2 功能的細胞及動物實驗多采用siRNA 干擾技術降低ANXA2 表達水平。 靶向ANXA2 的siRNA 進入細胞質后,通過RNA 誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)機制與ANXA2 mRNA 互補結合,從而引起目標mRNA 降解,實現細胞或生物體ANXA2 基因沉默[7-8]。 但siRNA 技術存在脫靶率問題,在基因敲除實驗中不能完全敲除目標基因。 在細胞核內合成的shRNA 可由Drosha 酶處理后轉運至細胞質,并經Dicer 酶將shRNA 加工成siRNA,shRNA 誘導的基因沉默較siRNA 更持久[7]。 通過將敲除ANXA2基因的胚胎干細胞注射至胚泡,并植入假孕小鼠的子宮中,經嵌合體雜交育種可產生穩(wěn)定敲除ANXA2的小鼠[9]。 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是新興的基因編輯技術,通過sgRNAs 序列特異性互補并切割靶DNA,導致基因部分序列缺失,精準實現基因敲除[10]。 但應用CRISPR/Cas9 基因編輯技術靶向ANXA2 的研究較少。 目前多采用構建靶向ANXA2 基因的DNA質粒轉染細胞實現基因的過表達[11]。

2 敲低或敲除ANXA2

2.1 敲低ANXA2 可抑制細胞上皮-間充質轉化及腫瘤細胞侵襲、遷移和增生

細胞上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有上皮表型的細胞失去極性和粘附性等上皮特征,轉化為具有間充質表型的細胞[12]。 目前,與ANXA2 相關的EMT 報道主要涉及腫瘤 增 殖、 侵 襲、 遷 移 方 面。 胰 腺 導 管 腺 癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA)是一種破壞性惡性疾病,ANXA2 屬于PDA 相關抗原,細胞表面ANXA2 的表達隨著PDA 的進展而增加。 Zheng等[13]通過建立小鼠PDA 模型證實了ANXA2 在細胞表面的定位依賴于酪氨酸23(Tyr-23)位點磷酸化,并可通過Rho 介導PDA 細胞中轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導EMT。敲低ANXA2 或使用抗ANXA2 抗體可有效抑制PDA轉移并提高模型小鼠存活率,為開發(fā)靶向ANXA2抑制劑治療人PDA 提供了理論依據[13]。 在鼻咽癌中,Chen 等[14]通過將靶向ANXA2 的shRNA 導入TW01 和BM1 鼻咽癌細胞系,建立特異性敲低ANXA2 細胞系,發(fā)現敲低ANXA2 可抑制TGF-β 誘導的Snail/Twist 癌癥相關轉錄因子的表達,抑制鼻咽癌細胞EMT 進程,從而減少細胞侵襲、遷移,同時可提高放射治療和化學治療敏感性。 2018 年,Rocha 等[15]基于對敲低ANXA2 的結腸直腸癌細胞研究,提出TGF-β 可通過其受體激活Src 介導ANXA2 磷酸化,磷酸化的ANXA2 一方面促進E-鈣粘蛋白內化,下調E-鈣粘蛋白轉錄,另一方面結合并激活STAT3,同時誘導STAT3 磷酸化,磷酸化的STAT3 從細胞質轉移至細胞核,上調EMT 相關轉錄因子Slug 的表達,進而上調波形蛋白和金屬蛋白酶MMP2/9 的表達[16]。

ANXA2 可在細胞膜、細胞質等不同的細胞結構部位介導表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)功能。 細胞質中的ANXA2 在蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和Src 激酶介導下實現N 端絲氨酸25(ser-25)和Tyr-23 位點磷酸化后,經鈣離子載體或鈣誘導劑移至細胞表面[17]。2019 年,Fan 等[18]研究表明,活化的蛋白激酶C 受體1(RACK1)是ANXA2 和Src 激酶的共受體,可介導兩者結合,促進ANXA2 磷酸化。 EGFR 由細胞外配體結合結構域和胞質C 端酪氨酸激酶結構域組成,Chaudhary 等[19]發(fā)現在三陰性和赫賽汀耐藥的乳腺癌細胞中,大量易位至細胞膜表面的ANXA2與EGFR 的細胞外結構域結合,在表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)誘導下導致EGFR 同源二聚化和酪氨酸激酶區(qū)域自磷酸化后脫離細胞膜內化進入細胞質。 內化過程依賴于脂質筏對EGFR 的內吞作用,而ANXA2 作為Ca2+依賴性膜結合蛋白,在富含膽固醇和/或磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸酯域中與肌動蛋白細胞骨架相互作用,可調節(jié)脂質筏形成[20]。 研究者利用抗ANXA2 抗體阻斷細胞表面ANXA2 功能可抑制EGF 誘導的EGFR 同源二聚化、酪氨酸磷酸化、內化和EGFR 介導的下游AKT和ERK 信號通路,從而抑制三陰性和赫賽汀耐藥乳腺癌細胞的細胞增殖和遷移[19]。 Wang 等[21]提出磷酸化的EGFR 可引起細胞質ANXA2 Tyr-23 位點磷酸化,觸發(fā)STAT3 途徑。 使用shRNA 在表達EGFR 的上皮樣乳腺癌細胞系T47D 細胞中穩(wěn)定敲低ANXA2,可抑制ANXA2 介導的STAT3 Tyr-705 磷酸化,降低STAT3 活化和核轉位,阻斷EMT 的發(fā)生發(fā)展,表明ANXA2 可通過STAT3 依賴性方式促進EGF 誘導的乳腺癌細胞EMT。 在宮頸癌細胞中,敲低ANXA2 可部分逆轉EGF 誘導的CaSki 宮頸癌細胞EMT 進程,并抑制CaSki 細胞活力和遷移[22]。 上述結果表明ANXA2 在EMT 進程中發(fā)揮重要作用,可能成為潛在的治療靶點。 同時也證明了ANXA2可在EGFR 信號通路的上游和下游發(fā)揮不同的作用,在EGF 誘導的EMT 信號通路中具有上通下聯(lián)的關鍵功能。

2.2 敲低ANXA2 抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，恢復順鉑耐藥細胞的藥物敏感性

ANXA2 作為引物識別蛋白參與DNA 復制[2],并通過不同的途徑參與細胞周期進程。 Wang 等[23]發(fā)現經皮下注射ANXA2 缺陷型人肺腺癌A549 細胞(shANXA2-A549)懸浮液的BALB/c 裸鼠的背側腫瘤結節(jié)明顯小于對照組,用siRNA 敲低體外培養(yǎng)的A549 細胞的ANXA2,同樣細胞增殖明顯受到抑制。 進一步證明敲低ANXA2 可抑制JNK/c-Jun 通路,并誘導p53 及其下游凋亡基因如p21 表達,引起細胞周期G2 期停滯,從而抑制細胞增殖[23]。 Zhang等[24]用shANXA2 慢病毒轉染人乳腺癌細胞系T47D 和MDA-MB-231,獲得穩(wěn)定敲低ANXA2 的細胞,發(fā)現敲低ANXA2 抑制EGF 誘導的STAT3 磷酸化,進而降低細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)水平。ANXA2 也是一種RNA 結合蛋白,可與原癌基因cmyc mRNA 的3′UTR 結合,從而導致其核周定位及與細胞骨架結合,并促進c-myc 蛋白的合成[5]。 Cmyc 在促進細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,Cyclin D1 是c-myc 的下游因子,也是細胞增殖的關鍵促進因子,可延遲細胞G1 到S 期轉變,抑制癌細胞增殖[5]。

順鉑是非小細胞肺癌患者的常用藥,主要通過與相關DNA 上的嘌呤相互作用,激活數個信號轉導途徑造成DNA 損傷和線粒體凋亡并最終導致細胞凋亡,然而治療過程中伴隨的細胞凋亡作用減弱可能是腫瘤細胞獲得順鉑耐藥性的關鍵特征[25-26]。Feng 等[27]通過體內外細胞實驗證明,非小細胞肺癌細胞的順鉑耐藥性與ANXA2 調控的JNK/c-Jun/p53 途徑中p21 等凋亡基因的異常表達密切相關,敲低ANXA2 增加了凋亡細胞數量,可部分恢復已耐藥細胞的藥物敏感性。 ANXA2 也可作為凋亡細胞表面C1q 的配體誘導自身裂解,抑制細胞周期促進凋亡[27]。 因此,ANXA2 基因可能用作耐藥性非小細胞肺癌的重要治療靶標。

2.3 敲低ANXA2 降低博來霉素誘導的肺纖維化

博來霉素是一種臨床應用廣泛的抗癌藥物,然而其誘導肺纖維化的發(fā)生率高達46%,嚴重限制了博來霉素的臨床使用和治療效果。 博來霉素誘導的肺毒性涉及氧化應激和其引起的DNA 損傷,從而引起炎癥反應。 2018 年一項研究發(fā)現,生理狀態(tài)下ANXA2 可通過肌動蛋白促進噬菌體裝配參與自噬過程[28]。 在小鼠肺部感染模型中,ANXA2 可通過肺泡巨噬細胞中的AKT-雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)途徑調節(jié)自噬[29]。 2018 年,Wang 等[28]利用CRISPR-Cas9 基因編輯技術和蛋白質組學方法證明了在A549 細胞中ANXA2 的Glu139位點可直接與博萊霉素二糖片段的酰胺基結合,二者的結合可抑制TFEB(轉錄因子EB)誘導的自噬通量,進而導致肺纖維化。 2019 年Lei 等[30]證明博來霉素可誘導肺上皮細胞中ANXA2 向細胞表面易位,并激活整合素連接激酶/核因子-κB(ILK/NFκB)途徑介導炎癥反應。 同時將博來霉素經氣管注射至缺失ANXA2 小鼠中14 d 后,通過Masson 染色和羥脯氨酸(膠原蛋白的標志物)定量分析證明,低表達ANXA2 小鼠肺間質厚度及胸膜下膠原沉積明顯小于對照組,NF-κB 磷酸化以及p65、IL-6 和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)等炎性因子表達水平降低[30]。 因此,ANXA2 可通過與博來霉素結合抑制自噬,促進炎癥反應誘導肺纖維化,下調ANXA2 的表達可能是降低博來霉素所致肺部毒副作用的有效方案。

2.4 敲低ANXA2 抑制炎癥

TNF-α 是TNF 超家族成員,介導一系列免疫反應,在炎癥性腸病的發(fā)展中起關鍵作用。 去整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinases,ADAM)17 是裂解TNF-α 前體的關鍵酶,參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[31]。 為了明確ANXA2 是否參與TNF-α 裂解脫落,Tsukamoto 等[32]在單核細胞和結腸上皮細胞系中運用siRNA 分別敲低ANXA2或ADAM,均顯著地抑制了細胞中TNF-α 的裂解脫落。 Tsukamoto 等[32]又運用免疫沉淀蛋白印跡法證實ANXA2 可直接結合并激活ADAM17,被激活的ADAM17 裂解TNF-α 的前體,使TNF-α 的釋放增加,從而加重炎癥反應。 因此,抑制ANXA2 可能是減少TNF-α 脫落,防治炎癥性腸病炎癥的新治療策略。

2.5 敲低ANXA2 減少細胞表面的低密度脂蛋白受體水平，增加高膽固醇血癥發(fā)生率

文獻顯示,前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9 型(proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9,PCSK9)的催化結構域可與低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)的EGF-A 結構域結合,在酸性條件下經由內體/溶酶體能有效誘導肝LDLR 降解,較低水平的肝LDLR 降低了血漿中低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 的清除率,導致高膽固醇血癥[33-34]。 ANXA2 基因位于染色體15q22.2 上,由13 個外顯子組成,ANXA2 的R1 結構域由外顯子4e6 編碼,外顯子4e6 具有8 個報告的單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism, SNP ),rs11633032 和rs17191344 為SNP 的功能性突變體,與LDL-C 水平正相關,其次要等位基因可產生轉錄因子阻遏蛋白結合位點,抑制ANXA2 基因表達[35]。ANXA2 通過其R1 域與PCSK9 富含半胱氨酸-組氨酸的結構域結合發(fā)揮PCSK9 功能的內源性抑制劑作用,ANXA2 單體和四聚體均可抑制PCSK9 對細胞表面LDLR 的降解活性,降低高膽固醇血癥發(fā)生率[35]。 Ly 等[34]發(fā)現用shANXA2 轉染人肝細胞癌細胞系Huh7 敲低ANXA2 細胞,可減輕ANXA2 對PCSK9 C 末端結構域M1 和/或M2 的抑制作用,使PCSK9 mRNA 在該細胞中翻譯增加,加速對LDLR降解,升高循環(huán)LDL-C 水平,證實敲低ANXA2 解除了對PCSK9 活性的抑制作用,提高了高膽固醇血癥風險。

3 過表達ANXA2

3.1 過表達ANXA2 加速纖溶酶產生導致腫瘤新血管生成及出血性疾病

p11 是鈣結合蛋白S100A10 的片段,在細胞內鈣濃度變化的驅動下,兩個p11 的C 末端結構域可與兩個ANXA2 單體的N 末端氨基酸結合形成異源四聚體[36]。 錨定于內皮細胞膜表面的ANXA2 四聚體是纖溶酶原和tPA 的共同受體,當ANXA2 過表達時可加速纖溶酶產生,并激活多種MMP(如MMP2,MMP9)參與下游蛋白水解級聯(lián)反應,促進細胞外基質、基底膜溶解,釋放內皮細胞以及基質中的血管生成調節(jié)劑(如血管內皮生長因子),啟動血管生成系統(tǒng)[5,37]。 膠質母細胞瘤是最常見和致命的腦腫瘤,Maruo 等[38]將犬神經膠質瘤細胞系J3T 經皮下植入無胸腺小鼠中,6 周后分別在腫瘤中收集到J3T-1 和J3T-2 細胞系,經檢測J3T-1 細胞系中ANXA2 表達水平高于J3T-2 細胞系,并且J3T-1 細胞主要聚集在腫瘤邊界處的擴張血管周圍,而J3T-2細胞則表現出彌散的單細胞浸潤到周圍正常的腦實質中,沒有新血管生成。 Onishi 等[39]用ANXA2 編碼質粒載體(pIRES-EGFP)轉染J3T-2 細胞建立過表達ANXA2 的J3T-2 細胞系,并將其接種在無胸腺大鼠中28 d 出現腦腫瘤,在腫瘤中心觀察到新血管生成而致血管擴張,同時血管內皮生長因子和血小板衍生生長因子的表達明顯升高。 2020 年一項最新的研究表明,在三陰性乳腺癌細胞中外泌體ANXA2 也可促進新血管生成[40]。 總之,以上結果表明過表達ANXA2 可通過促進血管生成因子表達誘導血管生成。

ANXA2 過表達時,纖溶酶合成量過高可致周圍組織受損,甚至引發(fā)出血,其中以急性早幼粒細胞白血病最具代表性。 其細胞具有特征性染色體易位t(15； 17),也稱為早幼粒細胞白血病/視黃酸受體α(PML/RARα)融合基因[41]。 PML/RARα 融合蛋白激活ANXA2 啟動子上調ANXA2 mRNA,過表達的ANXA2 可通過翻譯后調控導致p11 表達的增加,加速合成的ANXA2 四聚體促進纖溶酶以異常高的速率產生,大量活性纖溶酶在血漿中累積,最終導致急性早幼粒細胞白血病出血性并發(fā)癥[41]。然而,He 等[42]提出纖溶酶可特異性激活Toll 樣受體4 信號途徑誘導PKC 活化,啟動ANXA2 的ser-11 和ser-25 位點磷酸化,使四聚體解離,游離的p11 受到蛋白酶體依賴性多泛素化和降解,可阻止ANXA2 向細胞表面轉移,從而保持ANXA2 單體和四聚體的精確劃分。 纖溶酶的這種“反饋”機制可以限制自身的生成,從而維持血管纖溶系統(tǒng)平衡。

3.2 過表達ANXA2 促進上皮細胞增殖

據報道G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)可感知氨基酸的刺激,也可激活PKC 和蛋白激酶A(PKA),同時兩個蛋白激酶參與介導ANXA2 磷酸化,而激素是刺激牛乳合成和牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)增殖的最重要因素[43]。 因此,激素刺激下ANXA2 與乳蛋白合成和BMEC 增殖密切相關。Osorio 等[44]認為氨基酸如甲硫氨酸可誘導mTOR途徑相關蛋白磷酸化,對牛乳蛋白合成有積極作用。 2018 年, Zhang 等[43]為 了 研 究ANXA2 與BMEC 增殖和牛乳合成的分子機制,利用pcDNA3.1-ANXA2 構建體轉染BMEC 過表達ANXA2。 結果顯示,在氨基酸及雌激素刺激下,BMEC 中過表達的ANXA2 正向調節(jié)磷脂酰肌醇 3 - 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)產生PIP3,進而刺激mTOR 磷酸化,并增加固醇調節(jié)元件結合蛋白1c ( sterol response element-binding protein-1c,SREBP-1c) 和Cyclin D1 表達水平,經由PI3KmTOR-SREBP-1c/Cyclin D1 信號通路促進BMEC 增殖,合成乳蛋白、脂肪和乳糖等乳汁原料,加速乳汁合成[43]。 正如前所述,ANXA2 可能通過影響細胞周期因子促進增殖過程。

3.3 過表達ANXA2 參與多種病毒生命周期

文獻顯示,ANXA2 單體和四聚體可通過病毒-膜融合的內吞機制參與人乳頭瘤病毒、腸道病毒71、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒的附著和滲入細胞內,參與多種靶向上皮細胞的病毒裝配、復制和釋放等過程,也是促進體外流感病毒復制的前病毒宿主因子,在加速高致病性禽流感病毒H5N1 的復制中起著重要作用[45-46]。 2019 年一篇文獻顯示,非結構蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)是一種多功能蛋白,包含兩個不同的功能域：N 端RNA 結合域和C 末端效應域,效應域與宿主蛋白相互作用,抑制宿主免疫反應,調節(jié)病毒感染過程[47]。 為了研究ANXA2 與NS1 在禽流感病毒H5N1 復制中的具體作用機制,Ma 等[46]利用RT-PCR 擴增A549 細胞的ANXA2 基因,然后將其克隆到pCAGGS-HA 載體中,構建重組質粒pCAGGS-HA-ANXA2,再用質粒及GD1322(H5N1 菌株)轉染A549 細胞24 h,檢測到子代病毒滴度顯著增加。 免疫共沉淀實驗表明ANXA2 可作為NS1 的靶分子,并與NS1 C 末端效應域相互作用,加速病毒復制。 細胞凋亡是抵抗病毒感染的宿主防御機制,NS1 與p53 結合可抑制細胞凋亡,基于ANXA2 和NS1 之間的相互作用以及p53的潛在拮抗作用,NS1 可能作為橋接分子促進ANXA2 和p53 結合以抑制細胞凋亡[46]。

4 總結

ANXA2 可作用于EMT 進程的不同位點,在EGFR 介導的EMT 信號通路中具有上通下聯(lián)的作用。 ANXA2 具有博來霉素的結合靶點,兩者的結合可抑制自噬通量,進而導致肺纖維化。 作為支架蛋白,Tyr-23 位點磷酸化是ANXA2 由細胞質向細胞表面移位的關鍵環(huán)節(jié),ANXA2 四聚體可促進纖溶酶生成,裂解細胞外基質、基底膜,釋放血管生成調節(jié)劑促進新血管生成。 此外,ANXA2 還可調節(jié)細胞增生、炎癥和膽固醇代謝,參與病毒生命周期復制、凋亡等過程。 綜上所述,運用基因調控技術精準揭示了ANXA2 的病理作用,拓展了對ANXA2 作用機制的認識,有助于探索針對ANXA2 的腫瘤早期診斷和靶向治療,也有助于建立其他非腫瘤疾病的治療策略。