張曉敏，李向陽,牛憲立,蘇良辰,農(nóng)瑞敏

黃連為毛茛科植物，大苦大寒，屬傳統(tǒng)中藥，除了眾所周知的清熱解毒功效以外，越來越多的其他方面的功效逐漸被挖掘[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，黃連提取物中小檗堿有擴(kuò)張血管、降低血壓、調(diào)脂及抗血小板聚集等多種作用；黃連素還具有一定的抗氧化作用，對(duì)各種原因引起的腦損害具有一定保護(hù)作用[2]。缺血性腦疾病目前是致死、致殘率極高的常見疾病，嚴(yán)重影響人體健康和人類生活質(zhì)量。目前，人類在治療腦缺血及其后遺癥方面尚無特效藥物。本研究通過小鼠頸部單側(cè)總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)，造出小鼠缺血性腦損傷的模型，通過灌胃給藥的方式研究黃連對(duì)小鼠缺血性腦損傷海馬組織的作用[3]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康的SPF成年小鼠36只，體質(zhì)量約20 g，雌雄各半(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。藥品與試劑：黃連浸出液(熬制，稀釋后含生藥量2 mg/ml)、10%水合氯醛(秤取10 g的水合氯醛，溶于100 ml蒸餾水)、75%乙醇、生理鹽水、MDA試劑盒、蛋白含量試劑盒(試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所)。實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)(飛鴿牌TDL-80-2B)、水浴箱(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、酶標(biāo)儀(bio-tekElx800)及721分光光度計(jì)(上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組：將36只小鼠隨機(jī)分為給藥組、模型組及正常組，每組12只。分別用染色法給每組小鼠編號(hào)為1～12號(hào)，每組小鼠又分別分為6個(gè)小組，分4、6、10、12、24、48 h六個(gè)時(shí)間段取材。各小組稱重記錄每只小鼠的體質(zhì)量，以確定小鼠的麻醉和灌胃給藥劑量。所有小鼠正常飼養(yǎng)3 d。

1.2.2 腦缺血小鼠模型的制備：給藥組和模型組小鼠采用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉(0.35 ml/100 g)[4]后仰臥固定于固定板上，用75%乙醇消毒頸部手術(shù)部位后，剪開頸中正前皮膚及組織，找到小鼠右頸內(nèi)動(dòng)脈，用小型玻璃分針挑起小鼠動(dòng)脈血管，游離出附在動(dòng)脈血管上的迷走神經(jīng)[5]，用手術(shù)線將小鼠右頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎，阻斷該動(dòng)脈對(duì)腦部供血。將動(dòng)脈放回頸內(nèi)，然后整合傷口，手術(shù)針縫合傷口，75%乙醇消毒傷口，將手術(shù)后的小鼠放在溫暖的環(huán)境下等待蘇醒。所有小鼠正常飼養(yǎng)1 d再給藥。

1.2.3 給藥與取材：給藥組小鼠給予黃連浸出液按0.1 mg/g的劑量灌胃[6]，模型組和正常組以同樣的方法按劑量灌以生理鹽水。然后開始計(jì)時(shí)，4 h后，取每組小鼠的1號(hào)和2號(hào)，頸椎脫臼法處死立刻斷頭取腦，剝離出小鼠大腦中的海馬組織；6 h后，取每組小鼠的3號(hào)和4號(hào)，頸椎脫臼法處死立刻斷頭取腦，剝離出小鼠大腦中的海馬組織；以此類推，8 h后取每組的5號(hào)和6號(hào)，12 h后取每組的7號(hào)和8號(hào)，24 h后取每組的9號(hào)和10號(hào)，48 h后，取每組的11號(hào)和12號(hào)。剝?nèi)テ渌X組織，在培養(yǎng)皿中用PBS清洗取下的海馬組織，后轉(zhuǎn)移至勻漿器，按重量體積比(g/ml)的比例加入冷PPS，制成10%的組織勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，2 500 rmp/s離心15 min，收集上清液。準(zhǔn)確吸取上清液0.1 ml，加入PPS 0.9 ml稀釋為10%的上清液，冰箱-20 ℃保存。

1.3 觀察指標(biāo) (1)小鼠行為學(xué)變化；(2)海馬MDA含量測(cè)定：取10%上清液，按照蛋白含量試劑盒說明書，96孔板上樣后，通過酶標(biāo)儀測(cè)定各組樣本的蛋白含量，換算原始勻漿組織中蛋白含量，為下一步測(cè)定組織中MDA含量做準(zhǔn)備。取10%組織勻漿上清液，嚴(yán)格按MDA試劑盒說明書步驟操作，紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣品的吸光度，按說明書的公式計(jì)算每個(gè)樣品的MDA含量，記錄數(shù)據(jù)，取每個(gè)時(shí)間段樣品MDA含量的平均值通過Excel 2003繪制圖表，生成曲線圖。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠的腦供血情況 右頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)蘇醒后給藥組和模型組小鼠均出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，食欲不振，前行路線明顯不成直線，搖擺不定的現(xiàn)象。說明右頸動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)可能造成小鼠大腦供血不足，影響小鼠的行為。正常組小鼠較給藥組和模型組靈活，反映靈敏，食量正常。

2.2 小鼠海馬組織中MDA含量 MDA含量測(cè)定結(jié)果見表1，曲線圖見圖1。

表1 MDA含量測(cè)定結(jié)果 (nmol/ml)

圖1 小鼠海馬組織中MDA含量曲線圖

2.3 不同處理組間MDA含量比較 取每個(gè)時(shí)間段兩個(gè)樣本的平均值，進(jìn)行單因素方差分析：首先進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)：MDA含量結(jié)果顯示，3組不同處理組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.918，P=0.042)，時(shí)間區(qū)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.072，P=0.197)。進(jìn)一步做處理組間的兩兩多重比較。見表2。

表2 不同處理組間MDA含量比較

3 討 論

腦血管疾病主要發(fā)生于中老年人群體，隨著社會(huì)人口老齡化程度加重，腦血管疾病已成為備受社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。而多數(shù)腦血管疾病，如動(dòng)脈硬化，腦血栓均與腦缺血引起的疾病有關(guān)。在我國(guó)，腦缺血是腦血管主要病種之一，其致殘和病死率僅次于惡性腫瘤，在臨床上如何預(yù)防和治療腦缺血引起的組織損傷和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞已成為研究的重點(diǎn)問題[7]。人類腦血管病一般發(fā)生在動(dòng)脈的某一分支，最常見的是大腦中動(dòng)脈。以手術(shù)造成的小鼠局灶性腦缺血模型與人類腦血管疾病相似，能很好地模擬臨床中大腦中動(dòng)脈梗死這一現(xiàn)象[8]。大多數(shù)關(guān)于這方面的研究均選擇用大鼠或小鼠動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)建立腦缺血模型，因?yàn)樾∈蟮哪X部血管結(jié)構(gòu)近似于人類，來源充足，容易飼養(yǎng)，存活率高，而且價(jià)格合理[9]。

有研究表明，脂質(zhì)過氧化作用是腦缺血導(dǎo)致的主要炎性反應(yīng)之一[10]，MDA是機(jī)體中多種不飽和脂肪酸在氧自由基的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用而形成的一種脂質(zhì)過氧化物之一。不飽和脂肪酸的過氧化作用能引起細(xì)胞損傷，因而組織中的MDA的含量高低往往可間接反映組織細(xì)胞的損傷程度[11-12]。本研究結(jié)果顯示：正常組的小鼠海馬組織中的MDA含量總體較給藥組和模型組低，且波動(dòng)不大，與小鼠海馬組織不受損傷的理論基本符合。模型組MDA含量較正常組高，且隨時(shí)間上升，可能是因?yàn)樾∈蠛ｑR組織供血不足而造成損傷，隨時(shí)間的推移損傷程度增加，MDA含量隨之增加。給藥組MDA含量總體較正常組高，隨時(shí)間推移而上下波動(dòng)，給藥4～8 h，MDA含量不斷上升，因?yàn)榭赡苁屈S連浸出液藥效還未發(fā)揮作用或吸收的量不足，小鼠的海馬組織損傷程度隨缺血時(shí)間增加；8～24 h，MDA含量不斷下降到一個(gè)較低的水平，因?yàn)榭赡苁屈S連浸出液的功效發(fā)揮作用，使小鼠海馬組織得到一定的保護(hù)，MDA含量隨之降低；24～48 h，MDA含量又呈升高的趨勢(shì)，原因可能是黃連浸出液在小鼠體內(nèi)已消耗完，導(dǎo)致小鼠海馬組織又進(jìn)入缺血性損傷狀態(tài)，MDA含量又開始升高。由此可見，黃連浸出液在一定程度上降低腦缺血小鼠海馬組織中的MDA含量，對(duì)腦缺血小鼠的海馬組織有一定的保護(hù)作用。