鄧 強(qiáng)，程 燁，蘇江濤，柯賢炳

(1 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068; 2 武漢生物工程學(xué)院藥學(xué)院，湖北 武漢 430068)

紫草(Arnebiaeuchroma)為紫草科植物新疆紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，作為藥物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。紫草的有效成分主要有兩大類：一類是以萘醌類成分為主的脂溶性成分，另一類是以多糖為主的水溶性成分[2]。其中萘醌類成分具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]，其提取方法的研究對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。萘醌類成分極性較小，常用的提取溶劑有石油醚、氯仿等有機(jī)溶劑和植物油[6-7]。從產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的角度考慮，本研究首次選用了橄欖油為提取溶劑。橄欖油是世界公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物油，含有多種天然生理活性物質(zhì)[8]，通過(guò)提取萘醌類成分制作成的紫草油、紫草膏或潤(rùn)唇膏等，在中藥化妝品的開(kāi)發(fā)上將有較大的應(yīng)用前景。

響應(yīng)面法(Response surface methodology，RSM)是一種常用于優(yōu)化中藥材提取條件的方法。其運(yùn)用數(shù)學(xué)函數(shù)進(jìn)行分析，同時(shí)討論各因素之間的相互作用，從而得出最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，具有精度高、預(yù)測(cè)值精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化紫草中總萘醌的提取工藝，為紫草中萘醌類成分的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

粉碎機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠)；超聲機(jī)(濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司)；離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；UV1800型-紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.2 試劑

新疆紫草(湖北辰美中藥有限公司)；左旋紫草素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，純度>98%，供鑒別使用)；橄欖油(廣州歐博化妝品有限公司，化妝品級(jí)別)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液稱取左旋紫草素對(duì)照品2.5 mg于50 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05 mg/mL的左旋紫草素對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液稱取適量紫草中藥飲片，粉碎過(guò)3號(hào)篩，得紫草粗品，精密稱取紫草粉末1.0 g，置于100 mL的燒杯中，加入40 mL橄欖油于40 ℃下浸泡4 h，取上述橄欖油1 mL于10 mL容量瓶中加95%乙醇定容，即得。

2.2 線性關(guān)系考察

2.2.1 紫草含量檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇精密吸取1 mL左旋紫草素對(duì)照品溶液和紫草供試品溶液于不同10 mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻靜置，以無(wú)水乙醇為對(duì)照，在200～800 nm波長(zhǎng)下掃描，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)。結(jié)果表明，溶液吸光度在516 nm波長(zhǎng)處較大，故選擇516 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外-可見(jiàn)光譜圖見(jiàn)圖1。

(a)左旋紫草素對(duì)照品

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍考察分別精密移取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL左旋紫草素對(duì)照品溶液，于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻靜置，以無(wú)水乙醇為對(duì)照，在波長(zhǎng)為516 nm處測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(y)、濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到左旋紫草素對(duì)照品的回歸方程為y=20.96x+0.0292(r2=0.9988)，紫草檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.01～0.03 mg/mL。

2.3 新疆紫草中總萘醌的含量測(cè)定

精密量取上述樣品供試液2 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下的操作方法，再計(jì)算出樣品中總萘醌的量。

2.4 單因素考察實(shí)驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)總萘醌得率的影響精密稱取1 g紫草粉末，共5份，置錐形瓶中，依次加入10、20、40、60、80 mL的橄欖油，在25℃的條件下，浸泡4 h，每個(gè)樣品中取1 mL加入10 mL的無(wú)水乙醇超聲3 min，于3000 r/min離心。由圖2可知，隨著橄欖油體積的增加，總萘醌得率先上升后下降，當(dāng)橄欖油的體積為40 mL時(shí)，得率最高，故選擇料液比20、40、60 g/mL為后續(xù)優(yōu)化參考水平。

圖 2 料液比對(duì)總萘醌得率的影響

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)總萘醌得率的影響精密稱取1 g紫草粉末，共5份，置錐形瓶中，加入20 mL橄欖油，在25 ℃下分別浸泡1、2、4、6、8 h，在每個(gè)樣品中取1 mL加入10 mL的無(wú)水乙醇超聲3 min，于3000 r/min離心。由圖3可知，浸泡時(shí)間在4 h的時(shí)候，總萘醌的得率最高，故選擇2、4、6 h為后續(xù)優(yōu)化參考水平。

圖 3 提取時(shí)間總萘醌得率的影響

2.4.3 提取溫度對(duì)總萘醌得率的影響精密稱取1 g紫草粉末，共5份，置錐形瓶中，加入20 mL橄欖油，分別在20、40、60、80、100 ℃下浸泡4 h，在每個(gè)樣品中取1 mL加入10 mL的無(wú)水乙醇超聲3 min，于3000 r/min離心。由圖4可知，隨著提取溫度的升高，總萘醌得率先升高后下降，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)得率達(dá)最高，故40、50、60 ℃為后續(xù)優(yōu)化參考水平。

圖 4 提取溫度對(duì)總萘醌得率的影響

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1 方案設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)，綜合考慮影響紫草總萘醌得率的3個(gè)因素，即料液比(A)、提取時(shí)間(B)和提取溫度(C)，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，做響應(yīng)面的優(yōu)化研究。用-1、0、1分別表示因素的低、中、高三個(gè)水平，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)采用Design-Expert.10.0.7軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，以紫草總萘醌含量(Y)為響應(yīng)值對(duì)料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式方程擬合，得回歸方程為：

Y=2.30+0.047A-0.071B-6.25×

10-3C+0.013AB-0.038AC-0.06BC-

0.17A2-0.09B2-0.28C2

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析表

由表3可知，該模型的P<0.01，表明該回歸模型是顯著的，用該模型對(duì)紫草中總萘醌的提取工藝進(jìn)行分析驗(yàn)證是合理的。失擬項(xiàng)P=0.2990>0.05，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾很小，可以利用該模型確定最佳提取工藝條件。

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化圖及分析采用Design-Expert.10.0.7軟件進(jìn)行分析，得出相應(yīng)的響應(yīng)面圖。由圖5三維圖可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比在1∶35～1∶45范圍內(nèi)時(shí)，總萘醌的得率隨溫度的升高逐漸下降；等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明料液比和提取溫度之間的交互作用顯著；圖6等高線圖呈圓形，說(shuō)明提取時(shí)間和料液比之間的交互作用不顯著；由圖7三維圖可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，總萘醌的得率隨溫度升高逐漸下降，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明提取溫度和提取時(shí)間之間的交互作用顯著。因此在合適的料液比、提取溫度、提取時(shí)間下，紫草中總萘醌的得率會(huì)出現(xiàn)極大值。

圖 5 料液比和溫度響應(yīng)面圖

圖 6 料液比和時(shí)間的響應(yīng)曲面圖

圖 7 時(shí)間和溫度的響應(yīng)曲面圖

2.5.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過(guò)Design-Expert.10.0.7軟件對(duì)模型求解方程，得到最優(yōu)提取工藝條件，料液比1∶42.49，提取溫度46.05 ℃，提取時(shí)間4.04 h，在該條件下總萘醌含量達(dá)到最大值2.32%。為便于實(shí)際操作，將總萘醌的提取工藝調(diào)整如下，料液比1∶42，提取溫度46 ℃，提取時(shí)間4 h。在此條件下平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得率分別為2.22%、2.31%和2.25%，測(cè)得總萘醌平均得率2.26%，與模型預(yù)測(cè)值2.32%接近，表明該工藝條件穩(wěn)定、可靠，同時(shí)也說(shuō)明建立的回歸模型合理。

3 討論與結(jié)論

本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化紫草中總萘醌的提取工藝。研究表明，隨著溫度的升高或浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，紫草中總萘醌得率都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，推測(cè)其可能是紫草中蒽醌類結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定導(dǎo)致。有報(bào)道稱，紫草素具有光不穩(wěn)定性，萘醌類結(jié)構(gòu)中的羥基也使紫草素易被氧化[9-10]。本研究首次采用橄欖油作為提取溶劑。橄欖油是一種安全的食用油且含有多種天然的生理活性物質(zhì)，如VE、VK和類胡蘿卜素等[11]，在開(kāi)發(fā)一些中藥應(yīng)用產(chǎn)品時(shí)具有協(xié)同或增效的價(jià)值，并且本研究在紫草中總萘醌的提取上，采用橄欖油浸泡提取法，其操作簡(jiǎn)單，得率較高，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究采用橄欖油作為溶劑，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法成功優(yōu)化了紫草中總萘醌的提取工藝,優(yōu)化后的提取工藝合理可行。