劉奕清，雷 燕，楊 靜，修成奎，王 雪，胡艷紅，于博文，劉逸南，王佳麗，吳 丹，吳 燁

目前人口老齡化已成為全球廣泛關(guān)注的問題，截至2018年底，我國65歲及以上人數(shù)接近1.67億人，占總?cè)丝诘?1.9%[1]，由年齡增長帶來的退行性疾病如心血管疾病、骨質(zhì)疏松、阿爾茨海默病等逐漸成為重大的社會健康問題[2]。眾所周知，衰老是急慢性心血管疾病發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[3]，且疾病的發(fā)生率隨年齡的增長呈指數(shù)上升：因心臟病致死人數(shù)占65～74歲總死亡人數(shù)的40%以上，占85歲以上總死亡人數(shù)的60%[4]。因此，探究衰老對心臟的影響及其作用機(jī)制對預(yù)防心血管疾病的發(fā)生，提高老年人群的生活質(zhì)量具有非常重要的意義。目前，心臟衰老的分子調(diào)節(jié)機(jī)制主要包括線粒體功能障礙、端?？s短、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)以及自噬下調(diào)等[5-6]，但因心臟衰老涉及一系列復(fù)雜的生理過程變化，所以仍需對心臟衰老分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探究。

基因芯片作為凝結(jié)生命科學(xué)與信息科學(xué)研究成果的重要技術(shù)，已經(jīng)成為大規(guī)模提取和探索生物分子信息的強(qiáng)有力手段。隨著芯片技術(shù)的發(fā)展與普及，與疾病相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)儲存在各大公共數(shù)據(jù)庫中，海量差異基因可以輕易獲得[7]。本研究從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus， GEO)中獲取數(shù)據(jù)集GSE12480，利用生物信息學(xué)方法篩選年輕小鼠和年長小鼠心室中的差異基因，然后對差異基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes andgenomes， KEGG)信號通路分析，并且構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)獲得關(guān)鍵基因。使用關(guān)聯(lián)性圖譜(Connectivity map， CMap)篩選具有潛在治療作用的小分子藥物，為心臟衰老的早期診斷及發(fā)病機(jī)制提供重要的依據(jù)。通過以上分析，為進(jìn)一步研究小鼠心臟衰老的分子機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過GEO數(shù)據(jù)庫下載小鼠心室總RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE12480，其實(shí)驗(yàn)平臺為基于Affymetrix的GPL1261平臺。GSE12480數(shù)據(jù)集包括20個(gè)樣本，均取自于小鼠的心室RNA，其中包括10只年輕(4～6個(gè)月)和10只年長(25～28個(gè)月)小鼠樣本。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選 通過使用R語言(3.5.3， www.r-project.org)的limma包篩選出數(shù)據(jù)集GSE12480中年輕小鼠和年長小鼠的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>1，F(xiàn)DR(false discovery rate)<0.01。對差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，并繪制熱圖將結(jié)果可視化。

1.3 差異表達(dá)基因的GO功能富集和KEGG通路分析 使用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)在線分析工具，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。其中GO功能富集分析主要從生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component， CC)和分子功能(molecular function， MF)這3個(gè)方面進(jìn)行分析。同時(shí)使用R語言對GO功能富集和KEGG通路分析的結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵基因 使用STRING(https：//string-db.org)在線分析工具構(gòu)建差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。之后使用Cytoscape(http：//cytoscape.org/download_old_versions.html)軟件將蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，采用CytoHubba插件以節(jié)點(diǎn)自由度(Degree)>50篩選出關(guān)鍵基因。

1.5 差異表達(dá)基因的模塊分析 使用Cytoscape中的MCODE插件對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析，以MCODE分?jǐn)?shù)>10且基因數(shù)>20為標(biāo)準(zhǔn)篩選出關(guān)鍵模塊，并將關(guān)鍵模塊的基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析。

1.6 關(guān)聯(lián)圖分析 CMap(http：//www.broad.mit.edu/cmap)收集了1 309種化合物，含有7 000多個(gè)基因表達(dá)譜，揭示了疾病、基因和藥物之間的聯(lián)系，可用來發(fā)掘潛在治療疾病的藥物[8]。將差異表達(dá)基因上傳到CMap數(shù)據(jù)庫，篩選出關(guān)聯(lián)系數(shù)評分(Score)負(fù)相關(guān)居前5位的小分子化合物[9]。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 使用R語言limma包對年輕小鼠和年長小鼠心室基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，共篩選出471個(gè)差異表達(dá)基因，包括437個(gè)在年長小鼠中上調(diào)的基因和34個(gè)在年長小鼠中下調(diào)的基因(見圖1)。同時(shí)將差異最顯著的前50個(gè)基因進(jìn)行聚類熱圖分析，可視化差異表達(dá)基因在不同樣本中的表達(dá)見圖2。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖(紅點(diǎn)和綠點(diǎn)分別表示在年長老鼠心室中表達(dá)水平上調(diào)的基因和下調(diào)的基因)

圖2 年輕小鼠心室和年長小鼠心室中居前50個(gè)差異表達(dá)基因的聚類熱圖

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能富集和KEGG通路分析結(jié)果 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對471個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，并且使用R語言將每個(gè)分析結(jié)果的前10位進(jìn)行可視化(見圖3)。從GO分析結(jié)果可以看出，在生物學(xué)過程的分析中(見圖3A)，差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞黏附(cell adhesion)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、細(xì)胞外基質(zhì)組織(extracellular matrix organization)和血管生成的正調(diào)控(positive regulation of angiogenesis)等生物學(xué)過程。在細(xì)胞組分的分析中(見圖3B)，差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞外空間(extracellular space)、細(xì)胞外泌體(extracellular exosome)和蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(proteinaceous extracellular matrix)等。在分子功能的分析中(見圖3C)，樞紐模塊基因主要富集于蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、蛋白質(zhì)均二聚活性(protein homodimerization activity)、鈣離子結(jié)合(calcium ion binding)和肝素結(jié)合(heparin binding)等功能。從KEGG信號通路分析結(jié)果可以看出(見圖3D)，差異表達(dá)基因主要富集于PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、局灶性粘連(focal adhesion)和趨化因子信號通路(chemokine signaling pathway)等信號通路。

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析和KEGG通路分析(A為生物過程；B為細(xì)胞組分；C為分子功能；D為KEGG通路)

2.3 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 將471個(gè)差異表達(dá)基因輸入STRING在線分析工具，分析其蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。然后將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，形成可視化蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用插件CytoHubba，以Degree>50為標(biāo)準(zhǔn)篩選出5個(gè)關(guān)鍵基因(見圖4)，分別是纖維連接蛋白基因(fibronectin1，F(xiàn)n1)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C(Ptprc)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1， TIMP-1)、胰島素一號增長因子(insulin-like growth factors 1，Igf1)、內(nèi)皮細(xì)胞表面Ⅷ因子抗原(vonWillebrand factor，VwF)。

圖4 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

2.4 差異表達(dá)基因的模塊分析結(jié)果 使用Cytoscape中的MCODE插件以MCODE分?jǐn)?shù)>10且基因數(shù)>20為標(biāo)準(zhǔn)分析出了2個(gè)重要的模塊(見圖5)。對兩個(gè)模塊中的基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，模塊1主要與補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、局灶性粘連、P53信號通路和PI3K-Akt信號通路相關(guān)(見圖5A)，模塊2主要與趨化因子信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用和TNF信號通路相關(guān)(見圖5B)。

圖5 差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的模塊分析(A為模塊1；B為模塊2)

2.5 潛在治療藥物的篩選 CMap中的Score值處于-1～1，正值表示該藥物對疾病有促進(jìn)作用，負(fù)值表示該藥物對疾病有抑制作用，絕對值越大則表明相關(guān)性越大。處理后的差異基因映射到CMap數(shù)據(jù)庫，篩選出關(guān)聯(lián)強(qiáng)度居前5位的負(fù)相關(guān)小分子化合物，這些化合物對心臟衰老基因表達(dá)有抑制作用，Score負(fù)相關(guān)排名居前5位的小分子化合物見表1。

表1 位居前5位的具有潛在治療心臟衰老的小分子藥物

3 討 論

高齡已經(jīng)被認(rèn)為是心血管疾病如冠心病、中風(fēng)、周圍血管疾病和心力衰竭的主要危險(xiǎn)因素[10]，探究衰老對心臟的影響及其作用機(jī)制至關(guān)重要[11-12]。生物信息學(xué)綜合運(yùn)用計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)等工具，闡明和理解海量數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義，作為一門新興的交叉學(xué)科，如今已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中[13]。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取年輕小鼠和年長小鼠心室總RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE12480，利用生物信息學(xué)方法分析年輕小鼠和年長小鼠心室中表達(dá)具有顯著差異的基因，共篩選出471個(gè)差異基因，包括437個(gè)在年長小鼠中上調(diào)的基因和34個(gè)在年長小鼠中下調(diào)的基因。同時(shí)對差異基因進(jìn)行了GO功能富集分析和KEGG通路分析，并且通過構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)對差異基因所編碼蛋白質(zhì)間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了可視化分析，從而定義了Fn1、Ptprc、Timp1、lgf1、Vwf這5個(gè)關(guān)鍵基因。

通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，表明這些差異表達(dá)基因主要參與PI3K/Akt信號通路、局灶性粘連和趨化因子信號通路等作用。PI3K/Akt信號通路是細(xì)胞內(nèi)作用廣泛的一條通路[14]，參與衰老心肌細(xì)胞凋亡、使核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性、激活Bcl-2，從而起到抗衰老心肌細(xì)胞凋亡的作用[15]。PI3K主要通過激活A(yù)kt發(fā)揮促細(xì)胞存活和對抗凋亡的作用，Akt信號激活后可以抑制多種促凋亡因子[16]。有研究表明熱量限制是通過激活PI3K/Akt途徑，并部分改善心臟胰島素敏感性來防止衰老引起的心肌收縮力下降[17]。Hao等[18]對新西蘭大白兔進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)心臟收縮劑能夠通過PI3K-Akt信號通路，對慢性心力衰竭治療產(chǎn)生積極影響。細(xì)胞與纖維連接蛋白的局灶性粘連與血管僵硬有關(guān)[19]。研究表明對趨化因子的調(diào)控作用可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和相關(guān)心血管疾病[20-22]。本研究對篩選出來的差異表達(dá)基因的兩個(gè)重要模塊進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號通路分析，結(jié)果表明模塊1主要與局灶性粘連和PI3K-Akt信號通路相關(guān)，模塊2主要與趨化因子信號通路相關(guān)，證明這些信號通路與衰老的發(fā)生發(fā)展具有較高的相關(guān)性，值得進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步分析與衰老相關(guān)度較高的關(guān)鍵基因，本研究通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)定義了Fn1、Ptprc、Timp1、lgf1、Vwf這5個(gè)關(guān)鍵基因。Fn1是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，能夠促進(jìn)心內(nèi)膜分化[23]，研究表明人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞在接近復(fù)制性衰老時(shí)變成四倍體，從四倍體內(nèi)皮細(xì)胞的整體基因表達(dá)分析顯示Fn1的基因表達(dá)增加[24]。Ptprc是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳生物標(biāo)志，曲衛(wèi)玲等[25]研究發(fā)現(xiàn)，由生地、人參、茯苓和蜂蜜組成的瓊玉膏，可糾正Ptprc蛋白的異常表達(dá)量，調(diào)節(jié)NF-κB通路，從而延緩衰老。Timp-1是Timp家族中的一員，Timp是一個(gè)多基因家族的編碼蛋白，是基質(zhì)金屬蛋白酶活性的特異性抑制劑，基質(zhì)金屬蛋白酶活性與高血壓、動脈粥樣硬化和主動脈瘤等各種血管疾病有關(guān)[26]。Vigetti等[27]通過人主動脈平滑肌(AoSMC)連續(xù)傳代的體外衰老模型，發(fā)現(xiàn)TIMP-1和TIMP-2在老年AoSMCs中的表達(dá)和活性升高，從而支持了老年細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)活化受到抑制的假說。Igf-1被稱作“促生長因子”，是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)，在舒張血管、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞分化與創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用。從嚙齒動物到人類，Igf-1信號通路已成為衰老過程的主要調(diào)節(jié)劑[28]。隨著年齡的增長，脂肪組織中血管功能的改變會影響線粒體保護(hù)激素(如Igf-1)的合成與分泌[29]。VwF是第Ⅷ因子(factor Ⅷ， FⅧ)的載體蛋白，與動靜脈血栓形成和出血性疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[30]。Atiq等[31]研究發(fā)現(xiàn)老年1型血管性血友病病人與VwF和FⅧ水平升高之間存在關(guān)聯(lián)。

本研究通過CMap篩選了治療心臟衰老的潛在小分子化合物，白屈菜堿存在于罌粟科植物白屈菜中，有罌粟堿樣生物活性，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用，白屈菜提取物和主要生物堿能夠?qū)ERG鉀通道和犬心臟動作電位產(chǎn)生影響[32]。阿爾茨海默病與衰老有高度相關(guān)性[33]，STOCK1N-35696在Md.Rezanur的研究中被確定為治療阿爾茨海默病的新型潛在治療劑[34]。白屈菜堿、STOCK1N-35696等可能成為治療心臟衰老的新藥物。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法研究表明差異表達(dá)基因主要參與PI3K/Akt信號通路、局灶性粘連和趨化因子信號通路等作用，并篩選出Fn1、Ptprc、Timp1、lgf1、Vwf這5個(gè)關(guān)鍵基因。白屈菜堿、STOCK1N-35696等可能成為治療心臟衰老的新藥物，為進(jìn)一步探索心臟衰老的作用機(jī)制提供了新思路，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)差異表達(dá)基因和小分子藥物的功能。