陳 剛 何愛萍

(西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，西安 710077)

硫噴妥鈉作為臨床上比較常用的一種經靜脈使用的短效巴比妥類麻醉藥，具有較高的脂溶性，靜脈注射后極易通過血腦屏障，并作用于腦內抑制性神經遞質γ-氨基丁酸突觸，增加其對遞質的敏感性，同時又能阻斷興奮性神經遞質對突觸的作用，從而降低大腦皮層的興奮性，抑制維持大腦興奮和覺醒的上行網狀結構激活系統(tǒng)，降低神經生理和腦功能活動，并最終產生全身麻醉作用[1]。近年來國內外研究發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉除用于手術麻醉誘導與維持外，還可對免疫功能產生影響。如王軍等[2]在通過對比經硫噴妥鈉與異丙酚麻醉的胃癌患者發(fā)現(xiàn)，使用硫噴妥鈉可明顯抑制胃癌患者體內炎癥因子TNF-α與IL-6濃度。國外學者通過對比不同麻醉藥刺激外周單核細胞發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉能夠激活體內免疫抑制從而維持術后免疫平衡狀態(tài)[3]。LOOP團隊和ICHIYAMA團隊[4-5]均發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉可以通過抑制NF-κB的活性起到免疫抑制的作用。然而，硫噴妥鈉與NF-κB之間具體的作用機制尚不明確。

髓樣分化因子(myeloiddifferentiation factor 88,MyD88)是一種分子質量為34 kD的蛋白質，為NF-κB信號通路中的關鍵作用分子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，當機體受到環(huán)境中的不良刺激后，通過一系列反應能夠釋放穩(wěn)定存在于細胞骨架中的MyD88，使之激活并作為啟動下游信號傳導的靶分子進入胞質，而處于炎癥反應中樞地位的NF-κB隨即被活化而轉位入細胞核，與相應靶基因中的啟動子或增強子的κB位點結合，從而誘導靶基因的轉錄，啟動免疫反應的應答[7]。國內學者鄧娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)靜藥右美托咪定可明顯緩解脂多糖刺激下的小鼠肺組織中異常升高的MyD88與NF-κB蛋白含量。而麻醉藥丙泊酚可能通過抑制MyD88的表達下調多糖所誘導的中性粒細胞ROS的釋放。以上文獻提示MyD88在不同麻醉鎮(zhèn)痛藥所引起的炎癥反應中發(fā)揮重要作用，然而，目前尚無關于MyD88在硫噴妥鈉所引起的免疫抑制中作用的相關報道。本研究旨在研究硫噴妥鈉對巨噬細胞在脂多糖(LPS)誘導下免疫反應，并初步探討其相關作用機制，以期為硫噴妥鈉對圍手術期患者的免疫功能影響提供理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 人外周單核細胞系THP-1細胞(中國科學院細胞生物研究所)；RPMI1640(Hyclone公司，美國)；胎牛血清(FBS)、雙抗青鏈霉素(Gibco公司，美國)；佛波酯(PMA)、脂多糖(LPS)(Sigma公司，美國)；TRIzol (Invitrogen公司，美國)；RNA逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，日本)；HRP標記二抗(北京中杉)；IL-6、TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒(R&D公司，美國)； si-MyD88及對應的陰性對照組(上海瑞賽生物)； CD80-Percp(Biolegend公司，美國)RT-PCR引物合成(上海生工)；p65、p-p65(Abcam,美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分化及巨噬細胞鑒定 THP-1為懸浮細胞，常規(guī)復蘇細胞后接種于含1%雙抗、10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，傳代至3代后選擇生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。取處于對數(shù)生長期的細胞，調整細胞密度至1×106個/ml，并接種至24孔板，向細胞培養(yǎng)基中加入100 ng/ml的PMA孵育48 h，以誘導懸浮的THP-1單核細胞分化為巨噬細胞。當細胞貼壁后，去除細胞上清液，并用PBS輕輕沖洗3次，以去除未分化細胞及殘存PMA。重新加入含1%雙抗、10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基并通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.2細胞轉染及分組 取生長融合至50%的THP-1巨噬細胞，用Opti-MEM培養(yǎng)基調整細胞密度至3×105個/ml，并將si-MyD88及陰性對照序列si-NC分別轉入THP-1巨噬細胞中，根據Lipofect-amine3000試劑說明書進行操作，并將轉染后的THP-1巨噬細胞記為si-MyD88、si-NC。si-MyD88 轉染THP-1巨噬細胞48 h后，熒光顯微鏡觀察顯示轉染si-MyD88的細胞中可見綠色熒光蛋白，表明轉染成功。將細胞分為THP-1組，即無任何處理的THP-1巨噬細胞；抑制組，即si-MyD88組細胞；抑制組對應的陰性對照組，即si-NC組細胞。

1.2.3細胞流式實驗 取處于對數(shù)生長期的THP-1巨噬細胞并用含硫噴妥鈉(0、7.5、15、30 μmol/L)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用1 000 ng/ml的LPS刺激細胞24 h。PBS調整細胞密度至1×105個/ml,取2 ml細胞懸液至流式管中，3 000 r/min離心5 min，棄上清后，加入100 μl的PBS重懸細胞后，加入抗人CD80-FITC抗體，4℃避光孵育30 min后采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4ELISA 按1.2.3處理細胞并分組后收集細胞培養(yǎng)上清，3 000 r/min離心5 min，去沉淀，按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞中IL-6、TNF-α、IL-10的水平。實驗重復3次。

1.2.5RT-PCR實驗 收集生長狀態(tài)良好的si-MyD88組及對應的陰性細胞組細胞，按照TRIzol法提取細胞中總RNA，經酶標儀檢測純度與質量后，根據逆轉錄試劑盒說明書，取1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，進行RT-PCR反應。在按照RT-PCR配置體系加樣后，根據試劑說明書實時定量。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性 6 s，60℃退火，延伸37 s，40個循環(huán)。RT-PCR的引物設計如下：MyD88F：5′-CGATAGTTGGCACGTCGTGG-3′,R：5′-GTAGTCGAGTGCGCATGACA-3′;U6F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R：5′-AACGCTTCACGAATTTG-CGT-3′。以U6為內參，2-ΔΔCt法進行相對定量。

1.2.6Western blot實驗 收集生長狀態(tài)良好的si-MyD88組及對應的陰性細胞組細胞，置于冰上，加入RIPA裂解液，裂解30 min，12 000 g/min，4℃離心15 min后取上清液，BCA法進行蛋白定量，按1∶4比例向上清液中加入蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。SDS分離膠及濃縮膠配置完成后，加入相應體積的蛋白樣品及蛋白marker進行聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白條帶。待電泳結束后，300 mA電流90 min 進行轉模，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后，TBST洗膜3次，每次5 min。加入稀釋后的NF-κB p65(1∶500)、p-NF-κB p65(1∶850)、MyD88(1∶800)一抗，于4℃搖床孵育過夜。次日TBST溶液清洗3次，5 min/次，置于HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫振蕩1 h，再次 TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參β-actin的比值作為其相對含量。以上實驗重復3次，結果取其平均值。

2 結果

2.1THP-1巨噬細胞的形態(tài)鑒定 PMA誘導THP-1細胞分化48 h后，懸浮生長的THP-1單核細胞轉為貼壁的巨噬細胞，并從胞體伸出偽足，見圖1。

2.2硫噴妥鈉抑制THP-1巨噬細胞在LPS誘導下的免疫反應 流式細胞術及ELISA實驗結果均表明，單獨使用硫噴妥鈉處理THP-巨噬細胞時，對THP-1巨噬細胞表面CD80及炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10的分泌影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。當THP-1巨噬細胞預先被不同濃度的硫噴妥鈉預處理后，流式細胞術結果顯示，與對照組相比，硫噴妥鈉能夠明顯降低THP-1巨噬細胞表面CD80的表達(P<0.05)，且具有濃度依賴性；ELISA實驗結果顯示，與對照組相比，硫噴妥鈉能夠明顯降低THP-1巨噬細胞對炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10的分泌，且以高濃度的硫噴妥鈉(30 μmol/L)作用最為顯著(P<0.05)，見圖2。

2.3硫噴妥鈉對 LPS 誘導下的 THP-1 巨噬細胞中MyD88的表達影響 鑒于上述實驗結果，本部分實驗中選取30 μmol/L的硫噴妥鈉對THP-1巨噬細胞進行預處理。RT-PCR實驗結果顯示，硫噴妥鈉能夠明顯抑制LPS誘導下的THP-1巨噬細胞中MyD88 mRNA表達(P<0.05)；Western blot實驗結果顯示，硫噴妥鈉能夠明顯下調LPS誘導下的THP-1巨噬細胞中MyD88蛋白表達(P<0.05)，見圖3。

圖1 THP-1細胞形態(tài)變化(×200)Fig.1 Morphological changes of THP-1 cells(×200)Note:A.THP-1 monocytes;B.Differentiated THP-1 macrophages.

圖2 硫噴妥鈉抑制THP-1巨噬細胞在LPS誘導下的免疫反應Fig.2 Thiopental sodium inhibits LPS-induced immune response of THP-1 macrophagesNote:A～B.Flow chart and analysis of effect of thiopental sodium on the expression of CD80 on THP-1 macrophages induced by LPS;C～E stands for effect of thiopental on secretion of IL-6,TNF-α and IL-10 by THP-1 macrophages induced by LPS.*.P<0.05 vs LPS(+) thiopental sodium(0 μmol/L).

圖3 硫噴妥鈉對LPS誘導下的THP-1巨噬細胞中MyD88的表達影響Fig.3 Effect of thiopental sodium on MyD88 expression of LPS-induced THP-1 macrophagesNote:A.Effect of thiopental sodium on expression of MyD88 in LPS-induced THP-1 macrophages;B.Effect of thiopental sodium on expression of MyD88 in LPS-induced THP-1 macrophages.*.P<0.05,LPS(+) thiopental sodium(-) vs LPS(+)thiopental sodium(+).

圖4 THP-1巨噬細胞中MyD88的表達

2.4THP-1巨噬細胞中MyD88的表達 與THP-1組相比，si-MyD88組細胞中MyD88 mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)，si-NC細胞中MyD88變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Western blot實驗結果顯示與THP-1組相比，si-MyD88組細胞中MyD88 蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，si-NC細胞變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖5 MyD88抑制THP-1巨噬細胞在LPS誘導下的炎癥反應Fig.5 MyD88 inhibits LPS-induced inflammatory response of THP-1 macrophagesNote:A.MyD88 affects expression of CD80 on THP-1 macrophages induced by LPS;B～D stands for MyD88 affects secretion of IL-6,TNF-α and IL-10 by THP-1 macrophages induced by LPS.*.P<0.05 vs THP-1 group.

圖6 硫噴妥鈉抑制LPS誘導下的THP-1巨噬細胞中NF-κB信號通路磷酸化Fig.6 Thiopental sodium inhibits phosphorylation of NF-κB signaling pathway in LPS-induced THP-1 macrophagesNote:*.P<0.05,LPS(+) thiopental sodium(-) vs LPS(+)thiopental sodium(+).

2.5MyD88抑制THP-1巨噬細胞在LPS誘導下的免疫反應 流式細胞術結果顯示，與THP-1組相比，si-MyD88組細胞表面CD80顯著下降(P<0.05)，si-NC組細胞變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；ELISA實驗結果顯示，與THP-1組相比，si-MyD88組細胞的IL-6、TNF-α、IL-10水平顯著降低(P<0.05)，si-NC細胞變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

2.6硫噴妥鈉對LPS誘導下的THP-1巨噬細胞中NF-κB信號通路的影響 Western blot實驗結果顯示，硫噴妥鈉能夠明顯抑制LPS誘導下的THP-1巨噬細胞中NF-κB信號通路中p65蛋白的磷酸化(P<0.05)，見圖6。

3 討論

硫噴妥鈉作為速效巴比妥類麻醉藥，因其具有較高的脂溶性，極易通過血腦屏障，且能夠降低腦組織耗氧量并促進腦血管收縮，減少腦血流量，降低顱內壓等作用，因此常被用作顱腦手術、腦復蘇等必備藥品[9]。近年來，越來越多的學者認識到，圍手術期患者免疫功能紊亂可誘發(fā)一系列術后并發(fā)癥，如術后傷口愈合不良、癌癥患者腫瘤的復發(fā)或轉移等[1]。因此選擇合適的麻醉方法和藥品對術后患者的恢復及獲得良好預后具有重要意義。

巨噬細胞作為免疫細胞具有多種功能，其即可以作為吞噬細胞以清除病原體及細胞碎片，又可以作為分泌細胞來分泌多種細胞因子、炎癥介質等，故其在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用[10]。但由于外周血中巨噬細胞數(shù)量較少，且分離過程復雜等原因，因此常利用PMA誘導下THP-1單核細胞系分化為巨噬細胞作為體外實驗的細胞模型[11-12]。本實驗中，利用此方法成功誘導巨噬細胞免疫反應。LPS是革蘭性陰性菌外膜的主要組成部分，在生物體內可引起強烈的免疫反應，常被用來刺激巨噬細胞而形成感染和炎癥模型[13]。CD80多表達于各種免疫細胞如B細胞、T細胞、巨噬細胞等活化的APC表面，作為免疫系統(tǒng)激活的共同刺激信號參與調節(jié)機體各種免疫應答。在機體中，吞噬細胞在受到不良刺激活化后可分泌IL-6、TNF-α、IL-10等多種炎癥介質，有研究提示，在炎癥損傷的級聯(lián)反應中，巨噬細胞通過釋放大量的IL-6、TNF-α、IL-10等炎癥細胞因子入血，形成神經毒性因子并彼此之間相互作用，形成惡性循環(huán)，從而導致免疫功能紊亂[14]。

在機體內，活化炎癥反應的信號通路眾多，其中最重要的通路為TLR4/MyD88/NF-κB信號通路[15]。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)為固有天然免疫受體，此類受體廣泛分布于生物體中，且主要表達于巨噬細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞等表面，可對病原微生物的相關分子模式進行識別、結合并引發(fā)一系列信號轉導[16]。TLR4是真核生物體內介導LPS應答的主要受體[17]。研究發(fā)現(xiàn)，在機體受到LPS刺激時，TLR4位于胞內的TIR區(qū)域與MyD88的羧基端相結合，可進一步激活NF-κB信號通路，從而促進各種炎性因子的基因轉錄[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內特異性敲除MyD88基因后，在小鼠腹腔內注射大劑量LPS時，實驗組小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-10變化無統(tǒng)計學意義，而正常對照組小鼠在4天內均死于嚴重炎癥反應[19]。提示MyD88在LPS引起的免疫應答中起關鍵作用。RelA(p65)屬于NF-κB信號通路中關鍵作用蛋白，具有調控基因轉錄活性增強的作用。在炎癥反應發(fā)生時，IL-6、TNF-α、IL-10等炎癥介質及LPS等多種因素可誘導巨噬細胞、血管內皮細胞、肺組織中p65蛋白磷酸化，從而激活NF-κB信號通路，又可促進炎癥介質的釋放，從而加劇炎癥反應[20-21]。本實驗發(fā)現(xiàn)硫噴妥鈉能夠明顯抑制LPS對THP-1巨噬細胞中MyD88的mRNA及蛋白的表達。在THP-1巨噬細胞，硫噴妥鈉可能通過下調細胞中MyD88的表達以抑制細胞對LPS的免疫應答。并且硫噴妥鈉能夠抑制LPS誘導下的THP-1巨噬細胞中NF-κB信號通路的磷酸化，以抑制信號通路活化。

綜上所述，硫噴妥鈉能夠抑制巨噬細胞在LPS刺激誘導下的免疫反應，其作用機制可能與降低細胞中MyD88/NF-κB信號通路激活水平有關，本研究明確硫噴妥鈉在圍手術期患者免疫功能中的作用，然而，對于硫噴妥鈉在體內免疫系統(tǒng)中的其他作用機制有待進一步研究。