劉曉娟 王 靜 張 娟 高月月 王 虹

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，張家口 075000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，放射治療是其主要治療手段之一，放射治療的效果與其放射敏感性密切相關(guān)，而臨床上部分患者放射治療效果不理想，對(duì)放射不敏感是其主要原因[1-2]。研究宮頸癌放療敏感性的相關(guān)機(jī)制對(duì)克服宮頸癌患者的放療耐受及延長患者生存期具有重要意義。有報(bào)道顯示，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)廣泛參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，且lncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)與miRNA競爭性結(jié)合，調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和放療敏感性[3-4]。鋅指蛋白反義鏈1(zinc finger antisense 1，ZFAS1)是lncRNA家族中的一員，是多種腫瘤中的致癌分子，lncRNA ZFAS1通過調(diào)控BMI1和ZEB2促進(jìn)調(diào)節(jié)骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移[5]。沉默ZFAS1通過阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的生長、增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并增強(qiáng)了對(duì)順鉑或紫杉醇的敏感性[6]。miR-193a-3p的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p通過靶向LOXL4基因和氧化應(yīng)激途徑調(diào)節(jié)膀胱癌的多藥耐藥性[7]。miR-199a-3p在宮頸癌組織中低表達(dá)，而miR-199a-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響及ZFAS1是否通過miR-199a-3p影響宮頸癌細(xì)胞放射敏感性尚不明確[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制是否與miR-199a-3p有關(guān)，為宮頸癌放射治療的敏感性提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1組織來源 收集2015年1月至2019年1月就診于本院并確診為宮頸癌的患者134例，放射敏感組為3個(gè)月內(nèi)或局部復(fù)發(fā)在放療12個(gè)月內(nèi)未出現(xiàn)局部殘留病變的患者；放射抵抗組為原發(fā)腫瘤或發(fā)生轉(zhuǎn)移不完全消退大于3個(gè)月的患者及放射治療后12個(gè)月內(nèi)原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶均有局部復(fù)發(fā)的患者。兩組患者均于放療后進(jìn)行手術(shù)切除，其中放射敏感組和放射抵抗組各67例。

1.1.2細(xì)胞與試劑 宮頸癌細(xì)胞Siha購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、BCA試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天公司；60Co醫(yī)療照射裝置購自中國核動(dòng)力研究院。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞Siha用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的恒溫箱培養(yǎng)，每2～3 d換液一次，細(xì)胞融合至80%左右時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 實(shí)驗(yàn)分為pcDNA組、pcDNA-ZFAS1組、si-con組、si-ZFAS1組、IR+si-con組、IR+si-ZFAS1組、si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組、IR+si-ZFAS1+anti-miR-con組、IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組。

pcDNA組、pcDNA-ZFAS1組、si-con組、si-ZFAS1組：將pcDNA、pcDNA-ZFAS1、si-con、si-ZFAS1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Siha細(xì)胞；IR+si-con組、IR+si-ZFAS1組：將si-con組、si-ZFAS1組細(xì)胞用4 Gy 射線照射；si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組：將anti-miR-con、anti-miR-193a-3p質(zhì)粒分別與si-ZFAS1共轉(zhuǎn)染至Siha細(xì)胞；IR+si-ZFAS1+anti-miR-con組、IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組：將si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組細(xì)胞用4 Gy射線照射。

1.2.3qRT-PCR分析miR-193a-3p和lncRNA ZFA-S1表達(dá)水平 分別用0、2、4、6、8 Gy的60Co射線照射宮頸癌細(xì)胞Siha，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。miR-193a-3p和lncRNA ZFAS1的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。宮頸癌放射敏感組織和放射抵抗組織及其他各組細(xì)胞按上述方法檢測miR-193a-3p和ZFAS1表達(dá)水平。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集以上各組細(xì)胞提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次(10 min/次)后于暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，膠片采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集以上各組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化后，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期si-con組、si-ZFAS1組、si-ZFAS1+anti-miR-con組、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p組細(xì)胞，消化后以適中密度接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿，細(xì)胞融合達(dá)到80%左右，用60Co醫(yī)療裝置分別給予0、2、4、6、8 Gy 的射線照射。照射后，接種于60 mm培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d。PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。克隆形成率(planting efficiency，PE)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)(survival fraction，SF2)=照射劑量組的集落數(shù)/(該組細(xì)胞接種數(shù)×未照射組PE)。采用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，SF2=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D為照射劑量(Gy)，D0為平均致死劑量，Dq為準(zhǔn)閾劑量(代表存活的肩寬度)，N為外推值。放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)=單純照射組D0/聯(lián)合照射組D0。

1.2.7熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測ZFAS1對(duì)miR-193a-3p的靶向調(diào)控 Starbase預(yù)測顯示ZFAS1與miR-7-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)ZFAS1的熒光素酶表達(dá)載體(WT-ZFAS1和MUT-ZFAS1)，用Primer 3.0設(shè)計(jì)引物序列，WT-ZFAS1 F：5′-CCGCTCGAGTACACTATTGGCCAGTT-3′，R：5′-GAATGCGGCCGCTGAAGTGGGCACAGCC-TTTTA-3′；MUT-ZFAS1 F：5′-CCGCTCGAGTACACTATTCCGGTCAT-3′，R：5′-GAATGCGGCCGCTGAA-GTGGGCACAGCCTTTTA-3′。加粗的分別為XhoⅠ，NotⅠ酶切位點(diǎn)序列，之前為保護(hù)堿基，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為30 μl，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min 進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)條件為94℃ 1 min，60℃ 30 s；72℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延長5 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳后切膠回收，回收的PCR產(chǎn)物和pmir-RB-REPORTTM載體分別用XhoⅠ，NotⅠ進(jìn)行雙酶切，然后連接PCR產(chǎn)物與載體，產(chǎn)物與載體比例為3∶1，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μl大腸桿菌感受態(tài)DH5α，將用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切正確的產(chǎn)物重組載體送測，測序正確的用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期Siha細(xì)胞接種于24孔板(1×103個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，用LipofectamineTM2000將miR-con和miR-193a-3p的質(zhì)粒分別與WT-ZFAS1和MUT-ZFAS1共轉(zhuǎn)染至Siha細(xì)胞，按說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌細(xì)胞組織和Siha中l(wèi)ncRNA ZFAS1和miR-193a-3p的表達(dá) 與放射敏感組織相比，放射抵抗組織中ZFAS1表達(dá)水平顯著升高，miR-193a-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；不同輻射劑量照射宮頸癌細(xì)胞Siha后，ZFAS1表達(dá)水平顯著升高，miR-193a-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，圖1)。

2.2沉默lncRNA ZFAS1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞Siha凋亡 沉默ZFAS1及ZFAS1聯(lián)合4 Gy射線照射后，ZFAS1表達(dá)水平顯著降低，Cleaved Caspase-3表達(dá)水平顯著升高，Cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05，圖2)。表明沉默ZFAS1聯(lián)合4 Gy射線可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.3沉默ZFAS1增加宮頸癌細(xì)胞Siha放射敏感性 單擊多靶模型擬合計(jì)算得出，si-con組和si-ZFAS1組的D0值分別為2.50和1.69，si-ZFAS1組放射增敏比為1.48(表1)；在同一劑量照射下，si-ZFAS1照射組的細(xì)胞克隆形成數(shù)及存活分?jǐn)?shù)明顯低于si-con照射組；沉默ZFAS1及ZFAS1聯(lián)合4 Gy射線照射后，Siha中γ-H2AX表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，圖3)。提示沉默ZFAS1可增加宮頸癌細(xì)胞Siha的放射敏感性。

2.4lncRNA ZFAS1靶向miR-193a-3p Startbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示ZFAS1與miR-193a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)；相較于miR-con組，miR-193a-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ZFAS1載體的宮頸癌細(xì)胞Siha的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染MUT-ZFAS1載體的宮頸癌細(xì)胞Siha的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。相較于si-con組，si-ZFAS1組Siha細(xì)胞中miR-193a-3p的表達(dá)水平顯著升高；相較于pcDNA組，pcDNA-ZFAS1組Siha細(xì)胞中miR-193a-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，圖4C)。提示ZFAS1可靶向調(diào)控miR-193a-3p表達(dá)。

圖1 宮頸癌組織和Siha細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ZFAS1和miR-193a-3p的表達(dá)水平Fig.1 Expressions of lncRNA ZFAS1 and miR-193a-3p in cervical cancer tissue and Siha cellNote:Compared with radiosensitive tissue,*.P<0.05 ;compared with 0 Gy group,#.P<0.05.

圖2 沉默lncRNA ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Siha凋亡及相關(guān)蛋白的影響Fig.2 Effect of silencing lncRNA ZFAS1 on apoptosis and related proteins in cervical cancer cell SihaNote:1.si-con;2.si-ZFAS1;3.IR-si-con;4.IR+si-ZFAS1.*.P<0.05 vs si-con group；#.P<0.05 vs IR+si-con group.

2.5抑制miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)對(duì)沉默ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Siha的抑制作用 沉默ZFAS1聯(lián)合4 Gy射線照射后Siha中miR-193a-3p、Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表達(dá)水平顯著升高，Cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；沉默ZFAS1和miR-193a-3p及聯(lián)合4 Gy射線照射后，Siha中miR-193a-3p、Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05，圖5)。提示抑制miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)對(duì)沉默lncRNA ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Siha的凋亡促進(jìn)作用。

表1 沉默lncRNA ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Siha放射后單擊多靶模型擬合的參數(shù)值

圖3 不同劑量下宮頸癌細(xì)胞Siha存活曲線和4 Gy劑量下γ-H2AX蛋白表達(dá)

單擊多靶模型擬合計(jì)算顯示(表2)，si-ZFAS1組和si-ZFAS1+ anti-miR-193a-3p組的放射增敏比分別為1.34和0.79；在同一劑量照射下，IR+si-ZFAS1組的存活率明顯低于IR+si-con組，而IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p 組存活率明顯高于IR+si-ZFAS1+anti-miR-con組。提示抑制miR-193a-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)對(duì)沉默ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Siha的放射增敏作用。

圖4 lncRNA ZFAS1與miR-193a-3p的靶向關(guān)系Fig.4 Targeting relationship between lncRNA ZFAS1 and miR-193a-3pNote:*.P<0.05 vs miR-con group；Δ.P<0.05 vs si-con group；#.P<0.05 vs pcDNA group.

圖5 宮頸癌細(xì)胞Siha存活曲線、凋亡率及Caspase-3、Cyclin D1、γ-H2AX蛋白的表達(dá)

表2 沉默ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞Siha放射后單擊多靶模型擬合的參數(shù)值

3 討論

放療廣泛應(yīng)用于宮頸癌的臨床治療，使部分患者得到了較好的治療，但輻射抗性的出現(xiàn)使宮頸癌患者放療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)宮頸癌輻射抵抗、提高腫瘤治愈率是目前臨床亟待解決的難題[9]。研究表明，在多種腫瘤放射治療前后，部分lncRNA異常表達(dá)，可能通過調(diào)控細(xì)胞周期影響腫瘤細(xì)胞的放療敏感性[10]。ZFAS1是一種新的腫瘤相關(guān)的lncRNA，敲除ZFAS1可以增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)新型分子靶向藥物安羅替尼的敏感性[11-12]。ZFAS1還與卵巢癌患者的鉑類化療敏感性相關(guān)[13]。ZFAS1過表達(dá)通過引起細(xì)胞周期停滯和誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡而顯著抑制細(xì)胞增殖[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宮頸癌放射抵抗組織和不同劑量射線照射后的宮頸癌細(xì)胞中ZFAS1高表達(dá)，沉默ZFAS1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞放射敏感性。H2AX是組蛋白H2A家族成員之一，可作為電離輻射后DNA雙鏈斷裂損傷的標(biāo)志，其表達(dá)量的變化可反應(yīng)細(xì)胞的放射敏感性[15]。而Cleaved Caspase-3是細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白，其高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Cyclin D1則通過阻滯細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默ZFAS1促進(jìn)Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表達(dá)，抑制Cyclin D1表達(dá)。進(jìn)一步說明沉默ZFAS1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其放射敏感性。

有研究顯示，miR-193a-3p通過抑制Cyclin D1表達(dá)將細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[16]。本實(shí)驗(yàn)中抑制miR-193a-3p逆轉(zhuǎn)了沉默ZFAS1對(duì)Cyclin D1表達(dá)的抑制作用，提示其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p是非小細(xì)胞肺癌放療敏感性相關(guān)的miRNA之一[17]。miR-193a-3p在食管癌放射耐受細(xì)胞中高表達(dá)，抑制其表達(dá)細(xì)胞放射敏感性增加，促進(jìn)放射耐受細(xì)胞凋亡[18]。miR-193a-3p在肺癌中發(fā)揮腫瘤抑制劑的作用，miR-193a-3p通過調(diào)控下游基因ERBB4增加肺癌細(xì)胞放射敏感性[19]；miR-193a-3p在多藥耐受細(xì)胞SKOV-3中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞多藥耐受[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-193a-3p在放射抵抗宮頸癌組織和射線照射的宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，抑制miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默ZFAS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞的放射增敏和細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用，且ZFAS1靶向調(diào)節(jié)miR-193a-3p表達(dá)。說明lncRNA ZFAS1可能通過控miR-193a-3p影響宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。

綜上所述，lncRNA ZFAS1可增加宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性并促細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控miR-193a-3p有關(guān)，可為宮頸癌的放療提供新靶點(diǎn)和新思路。