蒲博強(qiáng) 邢曉偉 郭 祥

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院骨科，?？?570208)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的退行性骨關(guān)節(jié)疾病，其病理特點(diǎn)表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞，關(guān)節(jié)邊緣與軟骨下骨反應(yīng)性增生等。隨著年齡的增長(zhǎng)，骨關(guān)節(jié)炎的患病率升高，嚴(yán)重影響中老年患者的生命健康及生活質(zhì)量[1]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究顯示，軟骨細(xì)胞的異常增殖和凋亡在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡是治療骨關(guān)節(jié)炎的一種途徑[2-3]。蒼術(shù)是一種多年生草本植物，其根狀莖可入藥。研究顯示，蒼術(shù)提取物具有增強(qiáng)免疫、改善心臟功能、止痛、抗腫瘤等多種功效[4-5]，但其是否可影響軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡尚未闡明。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)小分子單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6-8]。荊琳等[9]研究顯示，miR-378c在骨關(guān)節(jié)炎組織中高表達(dá)，可能是膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的潛在致病基因。目前，miR-378c對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡的影響尚未闡明。本研究通過(guò)體外分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，探討蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其是否通過(guò)調(diào)控miR-378c表達(dá)發(fā)揮作用，以期為骨關(guān)節(jié)炎的藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來(lái)源 選取6例原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者行全膝人工關(guān)節(jié)置換術(shù)廢棄的退變關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，男2例，女4例，年齡61～76歲，平均年齡(72.39±3.57)歲。原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)骨關(guān)節(jié)炎診斷指南。本研究經(jīng)本院病理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者自愿簽署知情同意書(shū)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 蒼術(shù)飲片購(gòu)自武漢市九州通醫(yī)藥有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)基和BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-144-3p模擬物(mimics)及模擬陰性對(duì)照物、miR-378c抑制劑及陰性對(duì)照序列購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1蒼術(shù)提取物的制備 蒼術(shù)飲片干燥后粉碎，過(guò)40目篩，加3倍量蒸餾水，60℃回流2次，每次2 h。合并濾液，減壓濃縮至含生藥量1.0 g/ml，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，使用時(shí)培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2.2軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[10]方法分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。生理鹽水沖洗手術(shù)取下的軟骨標(biāo)本，低溫?zé)o菌保存。在1 h內(nèi)用含1%雙抗的預(yù)冷PBS緩沖液清洗3次。首先用手術(shù)刀片薄層削棄關(guān)節(jié)面外層軟骨組織，除去增生骨贅表面的薄層纖維軟骨。然后薄層削取關(guān)節(jié)中心區(qū)域的軟骨薄片并避開(kāi)軟骨下骨組織，用含1%雙抗的PBS清洗軟骨薄片，手術(shù)剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，然后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min。吸棄胰蛋白酶，用0.2%二型膠原酶37℃恒溫水浴消化18 h，1 500 r/min 離心10 min。棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基混懸，過(guò)200目篩，將細(xì)胞懸液用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后更換培養(yǎng)基，此后每2～3 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合至60%時(shí)，參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染miR-378c、anti-miR-NC、miR-378c mimics及miR-NC。轉(zhuǎn)染后6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)再培養(yǎng)至24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染anti-miR-378c、anti-miR-NC、miR-378c mimics及miR-NC細(xì)胞均以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，分組處理。未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞分為對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；IL-1β組：用含10 ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基分別作用軟骨細(xì)胞24、48、72 h；IL-1β+蒼術(shù)提取物-L、IL-1β+蒼術(shù)提取物-M和IL-1β+蒼術(shù)提取物-H組：用含10 ng/ml的IL-1β分別與5、10、15 μg/ml的蒼術(shù)提取物共同作用軟骨細(xì)胞24、48、72 h。轉(zhuǎn)染anti-miR-378c、anti-miR-NC的細(xì)胞均用含10 ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基作用48 h，記為IL-1β+anti-miR-378c組和IL-1β+anti-miR-NC組。轉(zhuǎn)染miR-378c mimics、miR-NC組細(xì)胞均用含10 ng/ml IL-1β與15 μg/ml蒼術(shù)提取物共同作用24、48、72 h，記為IL-1β+蒼術(shù)提取物-H+miR-378c組和IL-1β+蒼術(shù)提取物-H+miR-NC組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加20 μl濃度為5 g/L的MTT，孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻后，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度(optical density，OD)值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染anti-miR-378c、anti-miR-NC、miR-378c mimics及miR-NC細(xì)胞均以5.0×104個(gè)/孔接種于24孔板，培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)基，細(xì)胞分組同1.2.4，各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加入PBS清洗細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，取1.0×106個(gè)細(xì)胞，加入400 μl結(jié)合緩沖液，用移液器輕輕吹打混懸細(xì)胞。加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后，室溫避光孵育15 min。再加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，輕輕混勻后，室溫避光孵育 5 min。最后再加入100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-378c表達(dá) 采用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：miR-378c F：5′-GCACCGGTTAGCCGATTGCCG-3′，R：5′-TTGGCGGGTTAAGGCCGCA-AT-3′；U6 F：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG-3′，R：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-378c相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，置于冰上充分裂解30 min，裂解后，12 000 r/min離心10 min，上清液即為提取總蛋白。參照BCA蛋白測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白溶液于EP管中，密封后置于沸水中煮沸5 min。取出，冷卻至室溫，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，30 μg/孔。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，并于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入CyclinD1(稀釋度1∶800)、P21(稀釋度1∶400)、Bcl-2(稀釋度1∶600)和Bax(稀釋度1∶1 000)抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗IgG(稀釋度1∶200)，37℃孵育1 h。TBST洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑ECL，避光顯影。

2 結(jié)果

2.1蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，IL-1β組RPOC細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，P21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與IL-1β組相比，IL-1β+蒼術(shù)提取物-L組、IL-1β+蒼術(shù)提取物-M組和IL-1β+蒼術(shù)提取物-H組RPOC細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，P21蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。選用15 μg/ml的蒼術(shù)提取物作用48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1和表1、2。

2.2蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，IL-1β組RPOC細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與IL-1β組相比，IL-1β+蒼術(shù)提取物-H組RPOC細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖1 蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞CyclinD1、P21蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Rhizoma Atractylodis extract on express-ion of CyclinD1 and P21 proteins in IL-1 β-induced RPOC cells

表1 蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖的影響

2.3蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞中miR-378c表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，IL-1β組RPOC細(xì)胞miR-378c表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與IL-1β組相比，IL-1β+蒼術(shù)提取物-H組RPOC細(xì)胞miR-378c表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.4抑制miR-378c表達(dá)對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖、凋亡的作用 與IL-1β+anti-miR-NC組相比，IL-1β+anti-miR-378c組RPOC細(xì)胞活性、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-378c表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、P21和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表5、6。

2.5過(guò)表達(dá)miR-378c可逆轉(zhuǎn)蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 與IL-1β + 蒼術(shù)提取物-H+miR-NC組相比，IL-1β+蒼術(shù)提取物-H+miR-378c組RPOC細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-378c水平和P21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表7。

表2 蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞中CyclinD1、P21蛋白表達(dá)的影響

圖2 蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Rhizoma Atractylodis extracton apoptosis of IL-1β-induced RPOC cellsNote:A.Effect of Rhizoma Atractylodis extracton on apoptosis of IL-1β-induced RPOC cells;B.Effect of Rhizoma Atractylodis extracton on expressions of Bax and Bcl-2 protein in IL-1β-induced RPOC cells.

2.6過(guò)表達(dá)miR-378c可逆轉(zhuǎn)蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞凋亡的抑制作用 與IL-1β+蒼術(shù)提取物-H+miR-NC組相比，IL-1β+蒼術(shù)提取物-H+miR-378c組RPOC細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表8、圖5。

表3 蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞凋亡的影響

表4 蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞中miR-378c表達(dá)的影響

圖3 抑制miR-378c表達(dá)對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of inhibiting miR-378c on proliferation and expressions of apoptotic related proteins of IL-1β-induced RPOC cells

表5 抑制miR-378c表達(dá)對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖的影響

圖4 過(guò)表達(dá)miR-378c逆轉(zhuǎn)蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Overexpression of miR-378c reversed effect of Rhizoma Atractylodis extract on expressions of proliferation proteins of IL-1β-induced RPOC cells

表6 抑制miR-378c表達(dá)對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞凋亡的影響

表7 過(guò)表達(dá)miR-378c逆轉(zhuǎn)蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞增殖的影響

表8 過(guò)表達(dá)miR-378c可逆轉(zhuǎn)蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞凋亡的影響

圖5 過(guò)表達(dá)miR-378c可逆轉(zhuǎn)蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β作用的RPOC細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Overexpression of miR-378c reversed effect of Rhizoma Atractylodis extract on expressions of apoptotic proteins of IL-1β-induced RPOC cells

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，如年齡、外傷、軟骨組織新陳代謝失衡等。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一存在的細(xì)胞，近年來(lái)研究顯示，軟骨細(xì)胞的異常增殖和凋亡在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。IL-1β是一種致炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，在骨關(guān)節(jié)炎病變過(guò)程中破壞軟骨細(xì)胞的代謝平衡，可作為誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎體外模型的炎癥因子[12-13]。本研究顯示，IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力降低，凋亡加劇，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，P21和Bax蛋白表達(dá)升高，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致[14-15]。

蒼術(shù)具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，由黃柏、蒼術(shù)、牛膝、薏苡仁組成的四妙丸對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎具有較好的治療效果[16-17]。目前，蒼術(shù)提取物對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究顯示，蒼術(shù)提取物干預(yù)后，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖活性升高，凋亡降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，P21和Bax蛋白表達(dá)降低，提示蒼術(shù)提取物可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，具有成為治療骨關(guān)節(jié)炎藥物的潛在價(jià)值。

miRNA在真核生物體內(nèi)廣泛存在，參與調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡。如李坤等[18]研究顯示，miR-543在骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-543可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖，降低TNF-α、IL-6等炎癥因子表達(dá)。miR-378c是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，參與腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[19]。GUNGORMEZ等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-378c在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-378c可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可作為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物。ZHANG等[21]研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨干細(xì)胞中miR-378c表達(dá)差異與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程相關(guān)。目前，miR-378c對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究顯示，IL-1β誘導(dǎo)后，軟骨細(xì)胞中miR-378c表達(dá)水平升高，提示miR-378c參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-378c抑制劑至軟骨細(xì)胞抑制miR-378c表達(dá)后，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖能力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率及P21和Bax蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明抑制miR-378c表達(dá)可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，提示miR-378c可能是骨關(guān)節(jié)炎治療的潛在分子靶點(diǎn)。本研究還顯示，蒼術(shù)提取物可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞miR-378c表達(dá)，且過(guò)表達(dá)miR-378c逆轉(zhuǎn)了蒼術(shù)提取物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的RPOC細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，提示蒼術(shù)提取物與下調(diào)細(xì)胞miR-378c表達(dá)均可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，蒼術(shù)提取物可促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，其可能與下調(diào)細(xì)胞中miR-378c表達(dá)有關(guān)。