張 媛，吳 隼，郭 燕，王莉華，劉憲凱，黃 琰

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝453100

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）的侵襲性克隆性疾病，HSPCs 獲得突變后，導(dǎo)致骨髓分化受阻，產(chǎn)生具有自我更新能力的白血病干細(xì)胞（leukemia stem cells，LSCs），從而抑制正常的造血分化，引起貧血、出血、感染等一系列相關(guān)癥狀［1］。盡管隨著AML 相關(guān)的分子機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn)，患者的生存時(shí)間和治愈率得到了很大的提高，但仍然有近60%的患者會(huì)在2～3 a 后復(fù)發(fā)［2］，因此，進(jìn)一步探索與AML 發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制及其治療靶點(diǎn)具有重要意義［3］。

研究發(fā)現(xiàn)同源盒基因（homebox，HOX）家族是正常和惡性造血的重要調(diào)控因子［4］。HOX 基因家族是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，由A、B、C、D 四個(gè)亞族組成，每個(gè)亞族又包含9～11 個(gè)不同的基因［5］。HOXA5、HOXA9、HOXA13 等基因在白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用已經(jīng)有了相關(guān)研究，但HOXA3 在白血病中的作用及臨床意義仍沒有相關(guān)的闡述。

本研究基于生物信息學(xué)，利用Oncomine、TCGA、String-DB、DAVID等數(shù)據(jù)庫(kù)探索AML中HOXA3 蛋白表達(dá)差異及其相互作用的蛋白，并研究其與AML 預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 Oncomine v4.5 數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／www.oncomine.org／resource／main.html）是癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，可以根據(jù)實(shí)際需要設(shè)定篩選條件，進(jìn)行癌癥與正常組織、癌癥不同病理類型、癌癥與藥物治療敏感性的差異性分析。本研究搜索設(shè)置條件為：①Gene：HOXA3；②Cancer Type：Leukemia；③Data Type：mRNA；④臨界值設(shè)定條件（P value ＜0.001，fold change1.5，gene rank ＝Top 10%）。

1.2 String-DB v11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)

String-DB 數(shù)據(jù)庫(kù)［6］（https：／ ／string-db.org／）是研究基因和蛋白之間相互作用關(guān)系的平臺(tái)，其中包含已證實(shí)的和可預(yù)測(cè)的蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究檢索設(shè)定：HOXA3；Homo sapiens；medium confidence（0.400）；No more than 50 interactors。

1.3 DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)

將String-DB 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的與HOXA3 相互作用的50 個(gè)基因，使用DAVID［7］（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路分析，下載相關(guān)數(shù)據(jù)分析作圖，獲取與HOXA3 相互作用的基因改變的信號(hào)通路。

1.4 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／www.cancer.gov／about-nci／organization／ccg／research／structural-genomics／tcga）中下載LAML 相關(guān)的數(shù)據(jù)，使用R 3.6.3 軟件處理LAML 的數(shù)據(jù)，進(jìn)行HOXA3 相對(duì)表達(dá)量的分析，并下載LAML 的臨床數(shù)據(jù)，將生存數(shù)據(jù)和HOXA3 的表達(dá)數(shù)據(jù)合并，用Survival 包進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

kasumi-1（M2）、NB4（M3）、HL60（M3）、THP1（M5）、U937（M5）和TF-1（M6）六種白血病細(xì)胞由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院保存。細(xì)胞培養(yǎng)均用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2恒溫加濕。

1.6 Real-time PCR 檢測(cè)HOXA3 的mRNA 表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，利用TRIzol 提取總RNA。按照諾唯贊公司的反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA 置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用SYBR Green 法進(jìn)行PCR。所涉及的引物序列為：HOXA3-F：5′-ATGCAAAAAGCGACCTACTACG-3′；HOXA3-R：5′-TACGGCTGCTGATTGGCATTA-3′；GAPDH-F：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；GAPDH-R：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 和R 軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXA3 在不同腫瘤類型中的表達(dá)

在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索HOXA3，共有519 個(gè)有關(guān)的研究結(jié)果，其中HOXA3 表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果共28 個(gè)，HOXA3 表達(dá)增高的研究有14個(gè)，表達(dá)降低的研究有14 個(gè)，見圖1。在血液惡性腫瘤中，白血病中高表達(dá)的研究有3 個(gè)，淋巴瘤中高表達(dá)的研究有1 個(gè)，骨髓瘤中低表達(dá)的研究有1 個(gè)（臨界值設(shè)定條件：P value＜0.001，fold change 1.5，gene rank ＝Top 10%）。

圖1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中HOXA3在各種腫瘤組織中的表達(dá)情況

2.2 HOXA3 在白血病中的表達(dá)

對(duì)Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中的HOXA3 表達(dá)進(jìn)一步深入提取與白血病有關(guān)的研究信息，尋找與AML 相關(guān)的研究，通過設(shè)定篩選條件：①Gene：HOXA3；②Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③Cancer Type：Leukemia；④Data Type：mRNA；⑤臨界值設(shè)定條件（P value ＜0.001，fold change 1.5，gene rank ＝ Top 10%），共有7 個(gè)數(shù)據(jù)集涉及HOXA3 在白血病和正常組織中的表達(dá)，包括3 813 個(gè)樣本。比較4 個(gè)與AML 有關(guān)的研究結(jié)果［8］發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HOXA3 在AML 中高表達(dá)，且具有顯著性差異。

2.3 HOXA3 在AML 不同F(xiàn)AB 分型中的表達(dá)差異

將上述篩選條件中的Analysis Type 更改為Cancer Histology Analysis，重新篩選后，有19 個(gè)數(shù)據(jù)集符合條件，以TCGA Leukemia 為例，見圖2A。HOXA3 在M3 中的表達(dá)低于其他類型的AML，且在M5中表達(dá)水平最高。將kasumi-1、NB4、HL60、THP1、U937 和TF-1 六種不同F(xiàn)AB 分型的白血病細(xì)胞株提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR，結(jié)果顯示HOXA3 的表達(dá)與數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致，見圖2B。

2.4 與HOXA3 相互作用基因的GO 富集與KEGG功能注釋

下載TCGA 中AML 相關(guān)的數(shù)據(jù)，利用R 篩選出與HOXA3 共表達(dá)的基因，以相關(guān)系數(shù)≥0.4 為條件，共篩出780 個(gè)可能與HOXA3 具有共表達(dá)關(guān)系的基因。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述與HOXA3 相互作用的基因進(jìn)行GO 和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在生物過程（Biological Process，BP）中主要影響細(xì)胞凋亡、白細(xì)胞遷移、造血發(fā)生、T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等方面，見圖3A。在分子功能（Molecular Function，MF）中主要影響蛋白質(zhì)結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶激活參與的凋亡等，見圖3B。細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）中主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等位置，見圖3C。KEGG 代謝通路主要集中在P53、腫瘤、代謝相關(guān)等通路，見圖3D。

2.5 HOXA3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

在String-DB 數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢索分析與HOXA3 相互作用的蛋白，其中CTCF、PBX1、HOXB1、MAFB、KDM6A、KMT2C 等蛋白與HOXA3 關(guān)聯(lián)密切（圖4）。之前的文獻(xiàn)報(bào)道PBX1 可以通過活化AKT／GSK3β 信號(hào)通路來(lái)改變細(xì)胞周期，從而促進(jìn)毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡［9］，而MAFB 對(duì)胰島β 細(xì)胞的功能有重要作用［10］，提示HOXA3 可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、糖代謝等影響白血病細(xì)胞的生物學(xué)功能。

2.6 HOXA3 基因表達(dá)與AML 患者預(yù)后的關(guān)系

上述分析證實(shí)AML 中HOXA3 呈高表達(dá)，為進(jìn)一步分析HOXA3 與AML 患者預(yù)后的關(guān)系，在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的LAML 數(shù)據(jù)并用R 進(jìn)行處理分析，利用Survival包繪圖并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HOXA3 的AML 患者生存期明顯低于低表達(dá)者，提示HOXA3 與AML 患者的不良預(yù)后有關(guān)。

圖2 HOXA3 在AML 不同F(xiàn)AB 分型中的表達(dá)

圖3 HOXA3 相互作用基因的GO 富集和KEGG 通路分析

圖4 String-DB 數(shù)據(jù)庫(kù)中與HOXA3 相互作用的蛋白

3 討論

HOX 基因家族與正常和異常造血相關(guān)，其差異表達(dá)與特定的譜系和造血分化階段密切相關(guān)［11］。在小鼠造血干細(xì)胞中過表達(dá)HOXA10，導(dǎo)致髓系和B 細(xì)胞分化紊亂、巨核祖細(xì)胞擴(kuò)增，從而導(dǎo)致白血病發(fā)生。缺乏HOXA9 的小鼠造血功能受到破壞，包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞數(shù)量減少，而過表達(dá)HOXA9 可導(dǎo)致T 細(xì)胞發(fā)育缺陷和AML 的發(fā)生。而且，在AML 中HOXA9 參與MLL 融合蛋白的形成，且HOXA9 的激活是一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后標(biāo)志基因。報(bào)道［12］HOXA3 與很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，HOXA3 通過調(diào)節(jié)EGFR／Ras／Raf／MEK／ERK 信號(hào)通路來(lái)影響結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，miR-338-3p 可以下調(diào)HOXA3 的表達(dá)從而抑制T 淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤的發(fā)生。

本研究基于Ocomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了HOXA3 基因在不同惡性腫瘤中的表達(dá)情況，并且比較分析了4 個(gè)不同AML 數(shù)據(jù)集中HOXA3 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HOXA3 在AML 中的表達(dá)高于正常對(duì)照組，且在M5中表達(dá)最高，在M3 中的表達(dá)低于其他FAB 分型的AML，同時(shí)也利用白血病細(xì)胞的qPCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了與HOXA3 具有共表達(dá)關(guān)系基因的GO 富集和KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)HOXA3 與細(xì)胞的凋亡、白細(xì)胞遷移、造血發(fā)生、腫瘤、代謝等相關(guān)，提示HOXA3 可能在白血病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，進(jìn)行了生存分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HOXA3 的AML 比低表達(dá)組預(yù)后差。

雖然之前有很多關(guān)于HOX 基因家族和白血病的研究，但是關(guān)于HOXA3 和AML 的研究目前還沒有相關(guān)報(bào)道，后續(xù)仍需要相關(guān)的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)以及過表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究首次分析了HOXA3 在AML 中的表達(dá)及其與不同病理類型和預(yù)后之間的關(guān)系，并且報(bào)道了與其相互作用的蛋白和信號(hào)通路，為AML 的診斷和治療提供潛在的新靶點(diǎn)。