卓艷霞，孫明昌，張永卓

（濮陽市人民醫(yī)院，河南濮陽 457000）

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是最常見的白血病之一，在15歲以下的兒童中發(fā)病率最高[1]。雖然有研究表明，患有急性淋巴細(xì)胞白血病的兒童的五年總生存率近年已達(dá)到90%以上，但其高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和較差的預(yù)后仍然是目前臨床治療上較為棘手的問題之一[2]。因此，找到在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中具有較高價(jià)值的生物標(biāo)志物成為當(dāng)務(wù)之急。

MicroRNA（miRNA）是一大類單鏈非編碼小RNA（ncRNA），在調(diào)節(jié)各種基本的生理作用中扮演著重要的角色，其表達(dá)失調(diào)可能會(huì)在很大程度上導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展[3-4]。有研究表明，低表達(dá)的miR-326與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后等密切相關(guān)。例如，miR-326的下調(diào)與食道鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell carcinoma, NSCLC）患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-326在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，上調(diào)miR-326的表達(dá)可以通過下調(diào)NOB1的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖[7]。相關(guān)研究人員發(fā)現(xiàn)miR-326在前列腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，提示其可以作為前列腺癌診斷的生物標(biāo)志物[8]，但在兒童ALL中的相關(guān)研究還比較少。因此，本研究將以此為出發(fā)點(diǎn)，探討骨髓組織miR-326在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中的診斷及預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 樣本收集

收集在2014年8月～2019年8月期間來我院接受治療的70例兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者資料（均為新患者，不包括復(fù)發(fā)患者）歸入研究組。另收集30名健康志愿者資料歸入對(duì)照組，兩組間各基線水平未展現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，具有可比性。在健康志愿者中，未有人被診斷出患有任何急性淋巴細(xì)胞白血病。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和同意，所有患者的家長(zhǎng)均簽署知情同意書。

分別采集5ml各參試患者和健康志愿者的血液樣本，使用lymphoprep人淋巴細(xì)胞分離液（購自上海山進(jìn)生物科技有限公司，貨號(hào)：1114544）進(jìn)行密度梯度離心，得到含單個(gè)核細(xì)胞的血清后將其保存在-80℃的環(huán)境下。

1.2 RNA提取及定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

使用Trizol試劑（Ambion，卡爾斯巴德，加利福尼亞）按照說明書從組織樣品中提取總RNA。將分離出的RNA（2μg）使用PrimeScript TM RT試劑盒（Takara，Shiga，Japan）合成用于聚合酶鏈反應(yīng)分析的cDNA。在37°C進(jìn)行15min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后在85°C進(jìn)行5s的逆轉(zhuǎn)錄酶失活，將獲得的cDNA儲(chǔ)存在-20°C的環(huán)境下。根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書在SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-（QPK-212，Toyobo Co，Ltd，大阪，日本）系統(tǒng)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。按照以下條件進(jìn)行30個(gè)熱循環(huán)：95°C預(yù)變性5min，95°C變性20s，60°C退火30s，以及72°C延伸30s。GAPDH作為miR-326表達(dá)的內(nèi)參。用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-326血清相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所用到的基因的引物設(shè)計(jì)見表1：

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有研究數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件和SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析和處理。利用ROC評(píng)估m(xù)iR-326在兒童ALL中的診斷及預(yù)后價(jià)值。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 隨訪

70例患者每月隨訪一次，檢測(cè)患者體內(nèi)的miR-326表達(dá)水平的不同，觀察患者的預(yù)后效果。隨訪期從患者接受治療的第一天開始，截至2019年8月31日，70例患者隨訪6～60個(gè)月，隨訪時(shí)間中位數(shù)為32.5個(gè)月。共有2例患者失訪，總隨訪率為97.1%?？偵嫫冢╫verall survival, OS）是指患者從接受治療開始到因任何原因引起死亡的持續(xù)時(shí)間。無進(jìn)展生存期（disease-free survival, DFS）是指患者從接受治療開始到病情發(fā)生進(jìn)展或復(fù)發(fā)的生存時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 miR-326在ALL組織中表達(dá)下調(diào)且具有較好的診斷價(jià)值

此次研究使用qRT-PCR檢測(cè)了所有血液樣本中的miR-326的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，兒童ALL患者血液樣本中的miR-326表達(dá)水平明顯低于正常血液樣本（圖1A）。根據(jù)此次研究中ALL患者和正常樣本中血清miR-326表達(dá)水平繪制ROC曲線。由曲線可知，曲線下面積（area under the curve, AUC）：0.876；Cut-off值：1.875；敏感度：86.7%；特異性：92.9%；約登指數(shù)：79.6%。表明miR-326診斷兒童ALL具有很好的敏感度和特異性，且具有較好的診斷價(jià)值。由此可見，根據(jù)miR-326的表達(dá)水平可以將兒童ALL患者與健康志愿者有效進(jìn)行區(qū)分，見圖1B：

圖1 miR-326在正常血液和兒童ALL血液中的表達(dá)水平及診斷價(jià)值

2.2 miR-326表達(dá)與兒童ALL患者臨床病理特征的關(guān)系

此次研究將兒童ALL患者按照其miR-326的表達(dá)平均值分為高表達(dá)組（n=22）和低表達(dá)組（n=48），采用Fisher精確檢驗(yàn)檢測(cè)miR-326的表達(dá)水平與兒童ALL患者臨床病理因素的相關(guān)性。其中年齡、性別、T/B分型、臨床分型等與miR-326在組織中的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表2：

表2 患者的臨床病理因素

2.3 miR-326的低表達(dá)提示患者預(yù)后不良和較差的生存率

根據(jù)整個(gè)隨訪期間miR-326表達(dá)量的中位數(shù)將兒童ALL患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，記錄患者在隨訪期內(nèi)的生存時(shí)間，進(jìn)行總生存分析并繪制生存ROC曲線圖。另外，按病情是否進(jìn)展對(duì)患者進(jìn)行分組，進(jìn)行無進(jìn)展生存分析并繪制進(jìn)展ROC曲線圖?？偵娣治鼋Y(jié)果顯示，miR-326高表達(dá)組的總生存期明顯比低表達(dá)組的總生存期延長(zhǎng)，低表達(dá)的miR-326提示較差的總生存率（圖2A）。無進(jìn)展生存分析結(jié)果顯示，miR-326高表達(dá)組的無進(jìn)展生存期明顯比低表達(dá)組的無進(jìn)展生存期延長(zhǎng)，低表達(dá)的miR-326提示了較差的無進(jìn)展生存率（圖2B）。兒童ALL患者生存ROC曲線顯示AUC值：0.909；Cut-off值：1.665；敏感度：88.9%；特異性：81.2%；約登指數(shù)70.1%（圖2C）。進(jìn)展ROC曲線顯示AUC值：0.815；Cut-off值：1.64；敏感度：90.2%；特異性：73.7%；約登指數(shù)：63.9%（圖2D）。以上數(shù)據(jù)提示了低表達(dá)的miR-326與兒童ALL患者較差的預(yù)后相關(guān)。

圖2 miR-326總生存率和無進(jìn)展生存期及對(duì)應(yīng)的預(yù)后價(jià)值

3 討論

ALL是指由于骨髓、血液和其他造血器官中的淋巴母細(xì)胞單克隆活化和擴(kuò)張而引起的一組淋巴樣疾病。兒童ALL是最常見的兒童惡性腫瘤，占所有兒童癌癥的25%，占所有兒童白血病類型的80%[9]。在過去的幾十年里，兒童ALL的診斷和治療技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，治愈率從原來的10%提高到90%，整體的生存狀況有所改善[10]。到目前為止，兒童ALL主要以是否有發(fā)熱、出血、貧血等癥狀，體檢有無肝、脾、淋巴結(jié)腫大及胸骨壓痛，有無血小板減少，骨髓中一系列原始細(xì)胞含量是否超標(biāo)，作為診斷依據(jù)。但由于確診的因素太多，偶爾會(huì)出現(xiàn)診斷不及時(shí)或者與其他疾病混淆，耽誤最佳治療時(shí)間[11]。同時(shí)，盡管治愈率越來越高，較高的復(fù)發(fā)率仍然是兒童ALL治療中最為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，本研究目的在于尋找到可用于臨床早期診斷兒童ALL的可靠生物標(biāo)記物和預(yù)后標(biāo)記物，以提高診斷的精準(zhǔn)性并盡早識(shí)別出具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者。

miR-326是microRNA家族中的一員，在各種生理過程中扮演著重要的角色。相關(guān)研究人員發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，miR-326的低表達(dá)與臨床分期、腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)。生存分析表明，miR-326的低表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志[12]。此外，在食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，miR-326的低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[13]。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-326在肺癌組織中顯著下調(diào)[5]。在本研究中，我們收集了70份兒童ALL患者的血液樣本和30份健康志愿者的血液樣本，同樣地，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示兒童ALL患者血清中的miR-326的相對(duì)表達(dá)量較健康志愿者明顯下調(diào)。ROC曲線結(jié)果顯示AUC值為0.876，表明檢測(cè)miR-326的表達(dá)水平可以區(qū)分健康人群與兒童ALL患者。總生存分析結(jié)果顯示，miR-326高表達(dá)組的總生存期明顯比低表達(dá)組的總生存期延長(zhǎng)，低表達(dá)的miR-326提示較差的總生存率；兒童ALL患者生存ROC曲線顯示AUC值為0.909；無進(jìn)展生存分析結(jié)果顯示，miR-326高表達(dá)組的無進(jìn)展生存期明顯比低表達(dá)組的無進(jìn)展生存期延長(zhǎng)，低表達(dá)的miR-326提示了較差的無進(jìn)展生存率；無進(jìn)展ROC曲線顯示AUC值為0.815。以上數(shù)據(jù)表明miR-326低表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。有研究人員發(fā)現(xiàn)，miR-326在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的低表達(dá)也是整體生存預(yù)后不良的獨(dú)立標(biāo)志[14]。此外，相關(guān)研究人員發(fā)現(xiàn)，miR-326的表達(dá)水平在兒童ALL患者的預(yù)后中具有良好的診斷價(jià)值[15]，這與我們的研究結(jié)果比較一致。

雖然此項(xiàng)研究對(duì)于兒童ALL的早期診斷和預(yù)后具有一定的意義，但此次研究只納入了70例患者，樣本量較少，導(dǎo)致miR-326在兒童ALL中的表達(dá)量還不夠精確。需在以后的研究中加大樣本量，確定一個(gè)更準(zhǔn)確的值以用于兒童ALL的早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物。綜上所述，miR-326有可能成為兒童ALL的早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物。