馮苗苗，王曉梅，李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，顧晨刊，陳成勛

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

20 世紀(jì)60 年代，從老鼠和豚鼠的腹膜白細(xì)胞中分離得到具有抑菌活性的溶酶體陽離子蛋白[1]。1985年Lehrer 小組將從人類嗜中性白細(xì)胞中分離得到的具有廣譜抗菌活性的小分子蛋白命名為“defensin（防御素）”[2]，后來用防御素這一術(shù)語來描述在其他物種中發(fā)現(xiàn)的同源分子[3]。研究表明：防御素具有廣譜的抗菌活性，廣泛存在于動、植物體內(nèi)[4]。脊椎動物的防御素主要分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3 大類[5]，而魚體內(nèi)主要是β-防御素[6]。目前，已克隆了斑馬魚（Danio rerio）[7]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[8]、青（Oryzias latipes）[9]等多種魚類的β-防御素基因；研究發(fā)現(xiàn)魚類的多種組織器官均有β-防御素基因的表達(dá)，但表達(dá)水平具有種屬和組織器官差異[10,11]；病原微生物也會影響β-防御素基因的表達(dá)譜[12]。

革胡子鯰（Clarias gariepinus)原產(chǎn)于非洲，由于生長快、適應(yīng)能力強、可高密度養(yǎng)殖、抗病性強，已引種至東南亞、歐洲和南美洲的部分國家，并成為重要的淡水養(yǎng)殖魚類[13,14]，我國于1981 年引進(jìn)[15]。對革胡子鯰已有的研究報道主要集中在養(yǎng)殖條件（如水的理化因子、養(yǎng)殖密度和飼料）對其生長性能、血液生理生化指標(biāo)、組織抗氧化指標(biāo)的影響[14,16-22]或是水化因子及病原菌引起該魚的組織病理學(xué)變化[22,23]，但對革胡子鯰高抗病性的分子機(jī)制研究報道較少。因此，本研究應(yīng)用維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）感染革胡子鯰幼魚，應(yīng)用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)分析該魚3 種淋巴組織（脾臟、腎臟和頭腎）和3 種粘膜相關(guān)的淋巴組織（皮膚、鰓和腸道）中β-防御素基因的表達(dá)譜，旨在為從分子水平探討革胡子鯰對病原菌感染的免疫應(yīng)答機(jī)制積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及攻菌

試驗用魚和攻菌試驗與Li 等[24]的研究方法相同。革胡子鯰取自天津市德仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，在實驗室暫養(yǎng)10 d 后，挑選體質(zhì)量（63.84±5.91）g，體長（18.51±1.34）cm 的個體用于攻菌試驗。每尾魚腹腔注射0.2 mL 濃度為4×108CFU/mL 的維氏氣單胞菌，對照組注射同等劑量的生理鹽水。

1.2 采樣、RNA 提取及cDNA 第一條鏈的合成

注射后3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 和96 h 時感染組和對照組各取魚15 尾。試驗魚用200 mg/L 的MS-222 麻醉后，取脾臟、腎臟、頭腎、腸道、皮膚和鰓。應(yīng)用Trizol 試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取組織的總RNA，檢測其完整性、純度和濃度后，應(yīng)用RevertAid cDNA 第一條鏈合成試劑盒（美國Thermo 公司）合成cDNA 的第一條鏈。

1.3 引物的設(shè)計與評估

基于本實驗室革胡子鯰脾臟轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)中注釋為β-防御素基因的CDS 區(qū)，利用NCBI 在線設(shè)計擴(kuò)增β-防御素基因片段的引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，其引物序列引自Li等[24]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用常規(guī)PCR 和qPCR 檢測與評估后用于基因表達(dá)分析。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 的引物信息Tab.1 Information on the primers for qPCR used in the experiment

應(yīng)用2×rTaq PCR MasterMix 試劑盒（美國Quanta biotech 公司）進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增（25 μL），擴(kuò)增體系包括：1×rTaq PCR 混合液，引物Defensin-F 和Defensin-R 的終濃度均為0.3 μmol/L，cDNA 1 μL；循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35 個循環(huán)，72℃延伸補平5 min，每個反應(yīng)設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)。

1.4 組織樣本的基因表達(dá)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

qPCR 擴(kuò)增體系與循環(huán)參數(shù)同1.3。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，采用2ΔCT法分析革胡子鯰6 種組織β-防御素基因的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan 法多重比較數(shù)據(jù)間的差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物評估結(jié)果

β-防御素基因片段常規(guī)PCR 擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示：擴(kuò)增產(chǎn)物為一條泳帶，片段大小約為100 bp，與理論值相符。

圖1 β-防御素基因片段常規(guī)PCR 擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 The agarose gel electrophoresis of β-defensin gene fragments amplified by PCR

β-防御素基因片段qPCR 擴(kuò)增的熔解曲線為單一尖銳峰（圖2-A），引物的擴(kuò)增效率E=97.6%，R2=0.997（圖2-B）。這些結(jié)果說明：該對引物的特異性良好，擴(kuò)增效率符合qPCR 的試驗要求，可用于后續(xù)組織樣本的β-防御素基因的表達(dá)水平分析。

圖2 β-防御素基因片段qPCR 擴(kuò)增的熔解曲線峰值圖（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.2 Melt peak chart（A）and the standard curve（B）of qPCR amplification of β-defensin gene fragment

2.2 健康（對照組）革胡子鯰β-防御素基因的表達(dá)分析

由圖3 可知：對照組革胡子鯰6 種組織中均有β-防御素基因的表達(dá)，脾臟的表達(dá)量顯著高于其他5種組織（P<0.05），腸道的表達(dá)量顯著高于皮膚和頭腎的表達(dá)量（P<0.05），但與鰓和腎臟的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 對照組革胡子鯰6 種組織中β-防御素基因的相對表達(dá)量分析Fig.3 Relative expression levels of β-defensin gene in six tissues of African catfish C.gariepinus in the control group

2.3 革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后6 種組織β-防御素基因的時序表達(dá)分析

由圖4 可知：革胡子鯰感染維氏氣單胞菌3～96 h，6 種組織β-防御素基因的表達(dá)水平均上調(diào)，但時序表達(dá)譜有差異。試驗魚感染病原菌3 h，β-防御素基因在頭腎、皮膚和鰓中的表達(dá)量顯著高于對照組及感染后的其他時間點，分別為對照組的6.48、3.86 和1.80 倍（P<0.05）。頭腎中該基因的表達(dá)量在12 h 回到對照組水平，而皮膚和鰓中該基因的表達(dá)量在6 h 回到對照組水平。脾臟中β-防御素基因的表達(dá)量在24 h 顯著高于對照組及感染后的其他時間點（P<0.05），是對照組的2.76 倍。3 h 時腎臟和腸道中該基因的表達(dá)量最高，但與對照組差異不顯著（P>0.05）。

圖4 感染維氏氣單胞菌后革胡子鯰淋巴組織（A）和粘膜相關(guān)淋巴組織（B）β-防御素基因的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiles of β-defensin gene in lymphoid tissue（A）and mucosa-associated lymphoid tissue（B）of African catfish C.gariepinus challenged with A.veronii

2.4 革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后6 種組織間β-防御素基因表達(dá)的差異分析

由圖5 可知：在試驗魚感染病原菌后3 h，頭腎中β-防御素基因的表達(dá)量最高，顯著高于除脾臟外的其他組織，是對照（皮膚）組的2.34 倍（P<0.05）；感染6 h，脾臟中該基因的表達(dá)最高且顯著高于除頭腎外的其他組織，是皮膚表達(dá)量的7.01 倍（P<0.05）；12～96 h，該基因的表達(dá)量仍然在脾臟中最高，并且顯著高于其他5 種組織，達(dá)到皮膚中表達(dá)量的2.28～14.41 倍（P<0.05）。

圖5 感染維氏氣單胞菌后各時間點革胡子鯰6 種組織β-防御素基因相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of β-defensin gene in six tissues of African catfish C.gariepinus challenged with A.veronii at eight time points

3 討論

硬骨魚類的免疫器官和組織主要包括淋巴組織（如胸腺、腎臟和脾臟）和粘膜相關(guān)的淋巴組織（如腸道、皮膚和鰓），它們在魚類的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用[25,26]。

本實驗結(jié)果表明：健康魚（對照組）革胡子鯰革胡子鯰6 種組織中均有β-防御素基因表達(dá)，但表達(dá)存在差異。其中脾臟β-防御素基因的表達(dá)量顯著高于其他5 種組織；腸道該基因的表達(dá)量顯著高于皮膚和頭腎，但與鰓和腎臟的表達(dá)量差異不顯著。已有研究結(jié)果顯示，β-防御素基因1 和3 在健康斑馬魚的脾臟、腸道、皮膚、鰓和肌肉中均有較高表達(dá)；β-防御素基因2 僅在腸道呈弱表達(dá)[7]；健康虹鱒β-防御素基因1 和2 在頭腎、脾臟、皮膚、腸道和鰓中呈低水平表達(dá)，而β-防御素基因3 和4在上述組織中的表達(dá)水平較高[27]；而健康卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）β-防御素基因在腸道表達(dá)量最高，在皮膚和脾臟表達(dá)量較高，在鰓、頭腎和腎臟的表達(dá)水平中等，而心臟和肝臟表達(dá)水平較低[28]。本研究中，β-防御素基因在健康革胡子鯰體內(nèi)的表達(dá)與上述研究結(jié)果相似，都顯示β-防御素基因在健康魚體的多種組織器官可表達(dá)，說明該基因在魚體內(nèi)呈組成型表達(dá)，但表達(dá)水平存在組織差異性。

革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后，β-防御素基因在6 種組織的時序表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：感染病原菌后3-96 h，β-防御素基因在頭腎、皮膚和鰓中的表達(dá)水平在3 h 顯著高于對照組和感染后的其他時間點；該基因在腎臟、腸道的表達(dá)量也是在3 h 達(dá)到峰值，但與對照組差異都不顯著；而脾臟中該基因的表達(dá)水平在24 h 最高并顯著高于對照組和感染后的其他時間點。Zhao 等[9]使用革蘭氏陰性菌外膜的主要成分LPS（脂多糖，lipopolysaccharide，LPS）模擬細(xì)菌感染青鳉，發(fā)現(xiàn)感染6 h β-防御素基因在魚眼組織中的表達(dá)水平在顯著升高，12 h 達(dá)到峰值，為非感染組的12.9 倍。劉巧紅等[28]研究人工感染創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）的卵形鯧鲹時發(fā)現(xiàn)：感染8 h 頭腎中β-防御素基因表達(dá)量最高，72 h 時降低恢復(fù)至正常水平；脾臟在感染12 h 表達(dá)最高；腸道在12 h 表達(dá)量明顯增加，并在24 h 達(dá)到峰值。嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）感染俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）可強烈影響β-防御素基因的表達(dá)；感染6 h 后頭腎的表達(dá)量顯著增多；感染24 h 腸道和脾臟表達(dá)量最大且顯著高于對照組；24～72 h 脾臟的表達(dá)一直保持較高水平[29]。本研究結(jié)果與他人的研究結(jié)果均說明，β-防御素基因可被病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，隨著感染時間的推移而逐漸恢復(fù)到正常水平，但該基因的時序表達(dá)譜存在種屬差異和組織器官差異。

革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后相同時間點，β-防御素基因的表達(dá)水平具有組織差異性。感染病原菌3 h，該基因在頭腎中的表達(dá)水平顯著高于在皮膚、鰓、腸道和腎臟中的表達(dá)水平，但與在脾臟的表達(dá)水平差異不顯著。6～96 h 該基因在脾臟的表達(dá)一直保持最高水平，6 h 顯著高于除頭腎外的其他4 種組織，12～96 h 顯著高于其他組織。根據(jù)本試驗結(jié)果推測：在感染病原菌的早期（3 h 和6 h），革胡子鯰6 種組織中頭腎和脾臟在抵御病原菌入侵時起重要作用，而在感染中后期脾臟起主要作用。虹鱒感染魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）后48 h，3 種粘膜組織（皮膚、鰓和腸道）中β-防御素基因的表達(dá)均有變化：β-防御素基因2 在腸道中的表達(dá)水平顯著高于皮膚和鰓的表達(dá)水平，而β-防御素基因3 的表達(dá)水平為鰓高于皮膚和腸道[27]。鏈球菌（Streptococcusdysgalactiae）感染梭魚（Lizahaematocheila）24 h 后，脾臟、腎臟、腸道和肝臟β-防御素基因的表達(dá)均上調(diào)并且顯著高于對照組，此時脾臟中該基因的表達(dá)水平高于腎臟、腸道和肝臟該基因的表達(dá)水平[30]。這些結(jié)果說明：魚類感染病原菌后的同一時間點，不同組織器官中β-防御素基因的表達(dá)水平存在差異。

總之，本研究結(jié)果說明：革胡子鯰6 種組織都參與病原菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在感染早期（3 h），頭腎、皮膚和鰓中的β-防御素基因?qū)S氏氣單胞菌的應(yīng)答較快。在抵御病原菌侵染的過程中，筆者推測脾臟起更為重要的免疫防御作用。本研究結(jié)果為探討革胡子鯰抗病的分子機(jī)制積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于魚類養(yǎng)殖過程中飼料免疫添加劑的開發(fā)和疾病防治的研究。