蔡世欣，李 敏，侯余勇，王巍杰*，陳方見(jiàn)*

(1.華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210；2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308)

隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，世界石油消耗量急劇增長(zhǎng)，能源短缺問(wèn)題日益突出，生物質(zhì)能源作為可再生能源逐漸成為世界各國(guó)研究的熱點(diǎn)[1]。然而，原料成本高成為制約生物質(zhì)能源發(fā)展的主要瓶頸，低成本的植物纖維因可作為發(fā)酵底物而受到廣泛關(guān)注[2]。纖維素作為一種大分子多糖是目前分布最廣的生物質(zhì)，為生物質(zhì)能源的生產(chǎn)提供了大量原材料[3]。我國(guó)秸稈類(lèi)生物質(zhì)大多被直接燃燒，不但造成資源浪費(fèi)，還污染環(huán)境。利用秸稈發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇既能保護(hù)環(huán)境，也可充分利用資源，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。鑒于此，作者以蘆葦秸稈為原料，用堿液對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理以促進(jìn)秸稈纖維素糖化，再通過(guò)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)混合發(fā)酵制備乙醇，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

蘆葦秸稈，采自華北理工大學(xué)曹妃甸校區(qū)周邊。

纖維素酶，和氏璧生物技術(shù)有限公司；酵母膏、胰蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司；所用試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SLQ6A型粗纖維測(cè)定儀；THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器；T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；HHS-21-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母，鶴壁百惠生物科技有限公司。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(9.2 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸溶液+10.8 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶液，pH值4.8)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：2.0%蛋白胨、0.1%磷酸二氫鉀、1.0%磷酸氫二鉀、0.1%硫酸鎂、0.1%氯化鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.3 預(yù)處理方式的選擇

分別稱(chēng)取5.0 g粉碎過(guò)20目、40目、60目和80目篩的蘆葦秸稈置于錐形瓶中，按料液比1∶10(g∶mL,下同)加入50 mL堿液(NaOH或NaOH∶尿素=3.85∶1)，置于80 ℃水浴鍋中預(yù)處理2 h；將預(yù)處理過(guò)的蘆葦秸稈多次沖洗，烘干；采用粗纖維測(cè)定儀測(cè)定蘆葦秸稈中纖維素含量，以確定最優(yōu)的預(yù)處理方式。

1.4 發(fā)酵方式的選擇

發(fā)酵菌種的選擇：稱(chēng)取預(yù)處理后的蘆葦秸稈5.0 g，按料液比1∶30加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液和10%纖維素酶。將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或混合酵母(1∶1，釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母的配比)按10%接種量分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中；于30 ℃、150 r·min-1發(fā)酵70 h；然后采用DNS法[5]測(cè)定發(fā)酵液中還原糖含量，采用重鉻酸鉀比色法[6]測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量，以確定最優(yōu)發(fā)酵菌種。

混合酵母配比的選擇：將不同配比(1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4)的混合酵母按上述方法分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量，以確定混合酵母的最優(yōu)配比。

1.5 蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察混合酵母接種量(6%、7%、8%、9%、10%、11%)、纖維素酶用量(6%、8%、10%、12%、14%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)、轉(zhuǎn)速(120 r·min-1、130 r·min-1、140 r·min-1、150 r·min-1、160 r·min-1)、發(fā)酵時(shí)間(24 h、48 h、60 h、72 h、84 h)、發(fā)酵溫度(28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃)對(duì)乙醇含量的影響。

1.5.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

做好鄉(xiāng)鎮(zhèn)基層農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)工作任重而道遠(yuǎn)，只有結(jié)合鄉(xiāng)鎮(zhèn)基層農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)工作實(shí)際，在提高認(rèn)識(shí)、加強(qiáng)制度建設(shè)和管理，以及提高人員隊(duì)伍素質(zhì)等多方面入手，不斷努力改進(jìn)，才能切實(shí)形成整體合力，推動(dòng)基層農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)工作扎實(shí)開(kāi)展、有力開(kāi)展。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取混合酵母接種量、纖維素酶用量、料液比、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等6個(gè)因素的高、低水平(表1)，利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman(PB) 實(shí)驗(yàn)，篩選出影響最大的3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)；以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的中心點(diǎn)、采用Box-Behnken(BB)設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝條件。

表1 PB實(shí)驗(yàn)的因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖和乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 葡萄糖(a)和乙醇(b)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)圖1曲線進(jìn)行擬合，得葡萄糖和乙醇的線性回歸方程分別為：y=1.017x-0.0294(R2=0.9948)，y=20.047x-0.1046(R2=0.9988)。表明，葡萄糖含量在0～1.2 g·L-1范圍內(nèi)、乙醇含量在0～7 g·L-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 預(yù)處理方式對(duì)纖維素含量的影響(圖2)

從圖2可以看出，對(duì)于不同目數(shù)的蘆葦秸稈，采用添加尿素的混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預(yù)處理后的纖維素含量均明顯高于采用單一堿液(NaOH)的；其中60目蘆葦秸稈用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預(yù)處理后，纖維素含量達(dá)到60.7%。因此，確定采用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)對(duì)60目蘆葦秸稈進(jìn)行預(yù)處理。

圖2 預(yù)處理方式對(duì)纖維素含量的影響

2.3 單一酵母發(fā)酵和混合酵母發(fā)酵效果對(duì)比(圖3)

圖3 單一酵母發(fā)酵和混合酵母發(fā)酵效果對(duì)比

從圖3可以看出，混合酵母(1∶1)發(fā)酵時(shí)的乙醇含量明顯高于單一酵母發(fā)酵，比釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵時(shí)的乙醇含量分別提高了28.76%和42.78%。表明，蘆葦秸稈混合酵母發(fā)酵可以有效提高乙醇含量。因此，確定采用蘆葦秸稈混合酵母發(fā)酵制備乙醇。

2.4 混合酵母配比對(duì)乙醇含量的影響

當(dāng)釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母配比分別為1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4時(shí)，發(fā)酵液中乙醇含量分別為7.24 g·L-1、8.17 g·L-1、9.05 g·L-1、8.92 g·L-1、6.17 g·L-1。其中，在釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母配比為3∶2時(shí)，乙醇含量最高。因此，確定混合酵母最優(yōu)配比為3∶2。

2.5 最優(yōu)制備工藝

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)

從圖4a可以看出，隨著混合酵母接種量的增加，乙醇含量先快速升高后趨于穩(wěn)定；在混合酵母接種量為10%時(shí)，乙醇含量達(dá)到最高。因此，混合酵母接種量以10%較為適宜。

圖4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖4b可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，乙醇含量快速升高；當(dāng)纖維素酶用量超過(guò)10%后，乙醇含量升速趨緩。綜合考慮成本等因素，纖維素酶用量以12%較為適宜。

從圖4c可以看出，隨著料液比的減小，即檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量的增加，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。可能是因?yàn)?，檸檬?檸檬酸鈉緩沖溶液用量較少時(shí)，發(fā)酵液中酵母菌的密度較大，抑制了酵母菌的生長(zhǎng)，乙醇含量較低；當(dāng)含水量超過(guò)35%(料液比為1∶35)時(shí)，由于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量過(guò)多造成發(fā)酵液中酵母菌濃度降低，且發(fā)酵液體積大容易染菌、酵母菌與還原糖接觸的概率降低等原因?qū)е乱掖己肯陆?。因此，料液比?∶35較為適宜。

從圖4d可以看出，隨著轉(zhuǎn)速的增大，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢(shì)；在轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時(shí)，乙醇含量達(dá)到最高，為8.32 g·L-1。這是因?yàn)椋谝欢ǚ秶鷥?nèi)轉(zhuǎn)速的增大為發(fā)酵提供了更多的溶氧，為纖維素酶和蘆葦秸稈的充分接觸提供了有利條件，也為培養(yǎng)基提供了更多的溶氧，促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而積累了更多的乙醇。因此，轉(zhuǎn)速以140 r·min-1較為適宜。

從圖4e可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙醇含量不斷升高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)72 h后，乙醇含量趨于穩(wěn)定，可能是因?yàn)檫€原糖被完全消耗。因此，發(fā)酵時(shí)間以72 h較為適宜。

從圖4f可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢(shì)；在發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，乙醇含量達(dá)到最高，為8.02 g·L-1。這是因?yàn)椋l(fā)酵溫度較低時(shí)，酵母菌活性低，且纖維素酶糖化速率慢，導(dǎo)致糖供給不足影響了乙醇含量；雖然在較高的發(fā)酵溫度下，纖維素酶能更有效地促進(jìn)蘆葦秸稈纖維素糖化，但會(huì)影響酵母菌活性。因此，發(fā)酵溫度以32 ℃較為適宜。

2.5.2 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果分析見(jiàn)表3。

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從表2、表3可以看出，6個(gè)因素對(duì)乙醇含量影響的大小順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間>混合酵母接種量>發(fā)酵溫度>料液比>纖維素酶用量>轉(zhuǎn)速；其中發(fā)酵時(shí)間、混合酵母接種量和發(fā)酵溫度對(duì)乙醇含量的影響較大，且這3個(gè)因素對(duì)乙醇含量的影響均呈正效應(yīng)，效應(yīng)大小順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間>混合酵母接種量>發(fā)酵溫度。

2.5.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)快速獲得最大乙醇含量區(qū)域，有效建立響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

從表4可以看出，當(dāng)混合酵母接種量為12%、發(fā)酵時(shí)間為72 h、發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)，乙醇含量達(dá)到最高，為9.65 g·L-1。

2.5.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的混合酵母接種量12%、發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度34 ℃作為中心點(diǎn)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表5，結(jié)果見(jiàn)6，方差分析見(jiàn)表7。

用Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得回歸方程為：Y=-2345.18306+37.28339A+57.22313B+4.95892C+0.10856AB-0.12215AC+0.027879BC-1.84015A2-0.41166B2-0.082820C2。

從表7可以看出，模型F值為22.64，P值為0.000 2，表明模型有效；模型預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.990 6，精密度為46.981，表明模型數(shù)據(jù)可信度和精確度高，適應(yīng)性好，分析結(jié)果較為可靠；一次項(xiàng)A對(duì)乙醇含量影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)乙醇含量影響極顯著。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析

2.5.5 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖和等高線圖顯示每個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值的影響，可以直觀反映各因素之間的交互作用?；旌辖湍附臃N量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等3個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對(duì)乙醇含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

從圖5可以看出，各等高線圖中心呈橢圓形，表明混合酵母接種量與發(fā)酵時(shí)間、混合酵母接種量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度之間交互作用明顯；同時(shí)，響應(yīng)面圖開(kāi)口朝下，表明乙醇含量和3個(gè)因素之間呈拋物線關(guān)系。

通過(guò)響應(yīng)面分析得到蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)條件為：混合酵母接種量12.27%、發(fā)酵溫度33.86 ℃、發(fā)酵時(shí)間72.12 h?？紤]實(shí)際操作情況，確定最優(yōu)條件為：混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預(yù)處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發(fā)酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉(zhuǎn)速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發(fā)酵時(shí)間72 h、pH值4.8。

2.5.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行5組平行實(shí)驗(yàn)，得到乙醇含量平均值為9.81 g·L-1，與理論值偏差小于1%，符合預(yù)測(cè)范圍。因此，該模型可用于優(yōu)化蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝。

3 結(jié)論

以蘆葦秸稈為原料，利用混合堿液對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理促進(jìn)秸稈纖維素糖化，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定了混合酵母發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)工藝為：混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預(yù)處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發(fā)酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉(zhuǎn)速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發(fā)酵時(shí)間72 h、pH值4.8，在此條件下，乙醇含量達(dá)到9.81 g·L-1。