郭成栓，楊桂玲，劉曉珊

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510520)

纖維素酶包括β-葡聚糖外切酶、β-葡聚糖內(nèi)切酶和纖維二糖酶[1-3]。纖維素酶通常在酸性條件下發(fā)揮其催化作用，在堿性條件下酶活較低甚至沒(méi)有，從而限制了其在堿性環(huán)境中的應(yīng)用。堿性纖維素酶是一種缺少β-葡聚糖外切酶和纖維二糖酶的非全纖維素酶組分的β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶，不會(huì)破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，可以在堿性條件下發(fā)揮催化作用,被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、脫墨等行業(yè)[4-6]。洗滌劑中加入堿性纖維素酶，一方面可增強(qiáng)洗滌劑的去污能力，有效去除棉織物上的污垢；另一方面還能對(duì)棉織物起到保護(hù)作用，避免變黃、變硬，使顏色鮮艷并保持柔軟。分離堿性纖維素酶基因、構(gòu)建基因工程菌是提高堿性纖維素酶產(chǎn)量的重要方法之一[7-9]。此外，酶分子的定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化也為酶分子的改造提供了新的思路[10-13]。酶分子體外定向進(jìn)化模擬自然進(jìn)化，通過(guò)酶編碼基因的一輪或多輪突變，構(gòu)建酶突變基因文庫(kù)，經(jīng)過(guò)篩選得到所需性質(zhì)的酶[14-15]。定向進(jìn)化的方法主要有易錯(cuò)PCR、DNA shuffling等，根據(jù)待進(jìn)化的酶分子特性可選擇不同的方法。作者根據(jù)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在IPTG誘導(dǎo)下可以在LB-CMC平板上產(chǎn)生水解圈的原理[16-17]，在初篩和搖瓶復(fù)篩的基礎(chǔ)上，采用易錯(cuò)PCR法對(duì)β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因進(jìn)行定向進(jìn)化，從陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中篩選酶活提高的突變菌株。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

PCR產(chǎn)物純化試劑盒、IPTG，上海生工；膠回收試劑盒，Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、DNase Ⅰ、XhoⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RNase A、dNTPs、DNA抽提試劑，大連寶生物公司。

熱循環(huán)儀，凝膠成像系統(tǒng)，低溫冷凍離心機(jī)，全溫度恒溫氣浴搖床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，酸度計(jì)，垂直凈化工作臺(tái)，電子天平，滅菌鍋。

1.2 菌株、載體與培養(yǎng)基

大腸桿菌BL21(DE3)、表達(dá)載體pET20b，中科院昆明動(dòng)物研究所；pMD18T，大連寶生物公司。

LB培養(yǎng)基[18]。

1.3 β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[18]，提取短小芽孢桿菌DNA，克隆編碼β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶的基因，構(gòu)建表達(dá)載體pET20b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌BL21(DE3)/pET20b-EglA；在PCR反應(yīng)體系中添加不同量Mn2+，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，通過(guò)酶活比較篩選最佳的Mn2+添加量；參照TaKaRa公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA的酶切及連接；按Qiagen公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA的回收。

1.4 易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

設(shè)計(jì)一對(duì)引物5′-ATCTGGATCCATGCACATTTTTG-3′、5′-ATCGCTCGAGTTATTTATTCGGAAG-3′，分別引入BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切片段進(jìn)行鑒定[18]，構(gòu)建易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)。根據(jù)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在IPTG誘導(dǎo)下可以在LB-CMC平板上產(chǎn)生水解圈的原理進(jìn)行初篩，挑選水解圈與菌落直徑比值較大的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶復(fù)篩[19]，以篩選出酶活提高的突變菌株。

1.5 β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定

挑取BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA及BL21(DE3)/pET20b-EglA單菌落按1%的接種量接種至含50 μg·mL-1氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值在0.5～1.0之間；加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37 ℃誘導(dǎo)一定時(shí)間，取樣測(cè)定酶活[19]。

1.6 突變酶與野生酶的表達(dá)量分析

將BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA和BL21(DE3)/pET20b-EglA分別于LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)10 h，按1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入誘導(dǎo)物IPTG后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，10 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，用2×SDS上樣緩沖液于沸水浴中加熱5 min裂解菌體，離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，利用BandScan軟件測(cè)定突變酶及野生酶的表達(dá)量。

1.7 突變酶基因DNA及氨基酸序列分析

提取酶活提高突變菌株的重組質(zhì)粒，進(jìn)行DNA序列測(cè)定，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用BLAST軟件對(duì)突變酶基因進(jìn)行DNA及氨基酸序列分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 易錯(cuò)PCR堿基錯(cuò)配的引入

PCR反應(yīng)體系中的Mg2+或Mn2+不僅會(huì)使Taq DNA聚合酶的保真性大大降低，還會(huì)影響酶活。Mn2+添加量對(duì)易錯(cuò)PCR產(chǎn)物的影響如圖1所示。

M.DL5000 DNA marker 1.Mn2+添加量1 mL 2.Mn2+添加量2 mL 3.Mn2+添加量3 mL 4.Mn2+添加量4 mL

從圖1可以看出，隨著PCR反應(yīng)體系中Mn2+添加量的增加，DNA條帶亮度減弱，說(shuō)明催化合成的DNA量減少，突變率隨著Mn2+添加量的增加而升高。

將添加不同量Mn2+擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收、酶切、連接表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建突變文庫(kù)，根據(jù)平板上陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子比率篩選合適的Mn2+添加量。結(jié)果表明，50 μL反應(yīng)體系加入1 μL Mn2+，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子比率在60%左右，對(duì)建立隨機(jī)突變體系較合適。若Mn2+添加量過(guò)多，反應(yīng)體系的突變率太高，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子太少，此時(shí)大部分為負(fù)向突變，不利于篩選到正向突變菌株。

2.2 高酶活菌株的篩選

將易錯(cuò)PCR擴(kuò)增得到的DNA片段構(gòu)建到表達(dá)載體pET20b上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子周?chē)梢钥吹角逦乃馊?圖2a)；挑選水解圈與菌落直徑比值較大的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶復(fù)篩(圖2b)，可以看到，大部分的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子都發(fā)生了負(fù)向突變，有些陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子由于發(fā)生錯(cuò)配的堿基較多，從而失去了產(chǎn)酶活性，只有少部分的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子發(fā)生了正向突變。

圖2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在LB-CMC平板上產(chǎn)生的水解圈

選取5株水解圈和菌落直徑比值較大的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過(guò)1輪易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化，測(cè)得酶活(U·mL-1)分別為3.42、4.78、4.02、4.23、4.15，其中4株突變菌株所產(chǎn)酶的酶活得到提高，BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA2所產(chǎn)酶的酶活達(dá)到4.78 U·mL-1，為野生菌株BL21(DE3)/pET20b-EglA所產(chǎn)酶(3.60 U·mL-1)的1.32倍。

2.3 突變酶與野生酶的表達(dá)量分析

對(duì)BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA和BL21(DE3)/pET20b-EglA發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，誘導(dǎo)4 h后，菌株BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA和BL21(DE3)/pET20b-EglA均在73 kDa左右有β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶目的蛋白的表達(dá)條帶。利用BandScan軟件測(cè)定蛋白條帶的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)突變酶的表達(dá)量比野生酶提高了5%，而酶活卻提高了1.32倍，說(shuō)明突變酶的催化效率得到了提高。

M.molecular mass marker 1.誘導(dǎo)4 h后的BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA 2.誘導(dǎo)4 h后的BL21(DE3)/pET20b-EglA 3.未誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pET20b-EglA

2.5 突變酶與野生酶氨基酸序列的比較

基因測(cè)序結(jié)果表明，重組基因片段長(zhǎng)度為1 980 bp。對(duì)DNA序列分析可知突變酶基因序列中有3個(gè)堿基發(fā)生了突變，其中2個(gè)為胸腺嘧啶堿基突變?yōu)榘奏A基，突變位點(diǎn)分別位于1 760 bp和1 962 bp處，導(dǎo)致酶的氨基酸序列中2個(gè)氨基酸發(fā)生了改變：其中野生酶突變位點(diǎn)的密碼子AAA(106 bp)突變?yōu)镚AA，其編碼的氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼?；野生酶突變位點(diǎn)的密碼子TTT(1 760 bp)突變?yōu)門(mén)CT，其編碼的苯丙氨酸變?yōu)橘嚢彼?；? 962 bp處密碼子GGT突變?yōu)镚GC，但是其編碼的氨基酸沒(méi)有發(fā)生改變，為同義突變。

2.6 討論

應(yīng)用PCR方法對(duì)酶分子進(jìn)行改造，每一輪反應(yīng)堿基突變太多會(huì)造成負(fù)向效應(yīng)，一般要經(jīng)過(guò)多輪反應(yīng)才能將有益突變進(jìn)行積累，使進(jìn)化向正向突變定向進(jìn)行，從而取得較好的效果。

一級(jí)序列差異很大的蛋白質(zhì)能折疊成相似的三維結(jié)構(gòu)，而僅有少數(shù)氨基酸差異的蛋白質(zhì)卻呈現(xiàn)不同的三維結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律還遠(yuǎn)未被認(rèn)知，如何根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列折疊出其三維結(jié)構(gòu)是當(dāng)前研究的核心問(wèn)題。突變酶氨基酸改變太少，其空間結(jié)構(gòu)一般無(wú)法從三維結(jié)構(gòu)上觀察到。突變酶活性的提高可能是由于N端氨基酸的改變導(dǎo)致酶分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，進(jìn)而提高了其催化效率；也可能是由于C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸改變使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，導(dǎo)致酶分子周?chē)孜餄舛仍龃?，從而使底物更容易與催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而提高其催化效率[20-22]。

3 結(jié)論

根據(jù)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在IPTG誘導(dǎo)下可以在LB-CMC平板上產(chǎn)生水解圈的原理，在初篩和搖瓶復(fù)篩的基礎(chǔ)上，采用易錯(cuò)PCR法對(duì)β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因進(jìn)行定向進(jìn)化，從陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中篩選酶活提高的突變菌株。突變酶活性是野生酶的1.32倍，催化效率約為野生酶的1.26倍。突變酶基因DNA序列中有3個(gè)堿基發(fā)生了突變，導(dǎo)致氨基酸序列中有2個(gè)氨基酸發(fā)生了改變：野生酶突變位點(diǎn)的密碼子AAA(106 bp)突變?yōu)镚AA，其編碼的氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼?；野生酶突變位點(diǎn)的密碼子TTT(1 760 bp)突變?yōu)門(mén)CT，其編碼的苯丙氨酸變?yōu)橘嚢彼?；野生酶突變位點(diǎn)的密碼子GGT(1 962 bp)突變?yōu)镚GC，但是其編碼的氨基酸沒(méi)有發(fā)生改變，為同義突變。