徐嘉曦，楊清林，魏澤林，徐國良

(中國科學(xué)院 分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200031)

真核生物最早出現(xiàn)在10億年前，并依賴其復(fù)雜的代謝途徑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與增殖分裂調(diào)控等生物學(xué)機(jī)制占據(jù)了地球生態(tài)圈的各個(gè)角落。因?yàn)檫M(jìn)化的保守性，生物在基本的生命活動機(jī)制上具有相似性，所以利用生物復(fù)雜性較低和進(jìn)化地位較低的物種研究發(fā)育與進(jìn)化的共同規(guī)律是可行的。在具有不同進(jìn)化地位的生物中所發(fā)現(xiàn)的共同的形態(tài)特征與機(jī)制，往往代表著發(fā)育與細(xì)胞活動的普遍原理，而對于這些生物的研究也有助于我們理解生命活動規(guī)律的普適性和同一性。常用的模式生物如大腸桿菌、果蠅、擬南芥、斑馬魚和小鼠等，因?yàn)槠渖锾卣骶哂写硇?、生活世代短、背景清楚和易于?shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究。隨著科學(xué)技術(shù)水平的進(jìn)步以及研究領(lǐng)域的拓展，越來越多細(xì)分領(lǐng)域被拓展并給我們帶來了令人驚喜的發(fā)現(xiàn)，如對渦蟲和蠑螈再生領(lǐng)域的研究、雞胚胎發(fā)育的研究、殺人魚衰老和假死的研究、阿米巴細(xì)胞骨架重排調(diào)控的研究等。

阿米巴(Amoeba)廣泛分布在世界各地淡水和濕地中,并被發(fā)現(xiàn)與魚類等淡水生物密切相關(guān)。阿米巴中，耐格里阿米巴(Naegleriaspp.)為一個(gè)屬的統(tǒng)稱，而其下的Naegleriagruberi是該屬的一個(gè)代表性物種，它能夠在實(shí)驗(yàn)室體系下培養(yǎng)并進(jìn)行相關(guān)研究[1]。本文以耐格里阿米巴作為主要介紹對象。它最廣為人知的特點(diǎn)在于能夠進(jìn)行3種形態(tài)的切換，包括能夠進(jìn)行有絲分裂的阿米巴形態(tài)、短暫的不能分裂的鞭毛體形態(tài)(Flagellate)和休眠的胞囊狀態(tài)(Cyst)，見圖1。由于從阿米巴形態(tài)轉(zhuǎn)變到鞭毛體形態(tài)需要構(gòu)建完整的微管骨架并組裝基體(相當(dāng)于中心粒)和鞭毛，所以耐格里阿米巴被廣泛用于研究微管的生物學(xué)合成與組裝以及基體的從頭合成，F(xiàn)ulton等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)耐格里阿米巴有55個(gè)中心粒合成相關(guān)的基因，并在分化的早期就開始大量表達(dá)，而82個(gè)鞭毛合成相關(guān)的基因隨后開始表達(dá)。Naegleriagruberi以捕食細(xì)菌為食，沒有寄生性，但其近屬親緣物種福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)能夠入侵人腦產(chǎn)生致命性腦膜炎。當(dāng)然福氏阿米巴也并不是專性寄生蟲，在通常情況下它們依然以細(xì)菌為食物來源[1,4]。對于耐格里阿米巴的深入研究，或許能夠解開福氏阿米巴和其他寄生蟲入侵機(jī)制和宿主內(nèi)寄生機(jī)制的謎題。

單細(xì)胞真核生物運(yùn)動主要依賴于爬行和游動，這兩種運(yùn)動模式的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)來源于兩個(gè)保守的細(xì)胞骨架系統(tǒng)：細(xì)胞的爬行運(yùn)動來源于肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，而細(xì)胞的鞭毛游動則來源于微管的相對滑動。在阿米巴生命周期中，它主要呈現(xiàn)的是利用肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)爬行的阿米巴形態(tài)。在遇到低滲環(huán)境和機(jī)械振蕩時(shí)，它會縮回偽足并轉(zhuǎn)變成具有兩到四根鞭毛的橢圓球狀鞭毛體。該過程伴隨著肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的解聚和微管復(fù)合物的重新組裝，在28 ℃下整個(gè)過程只需要不到 60 min，其中幾乎100%的群體能夠在幾分鐘內(nèi)從沒有中心粒過渡到有兩個(gè)中心粒，能夠在這兩種形式之間隨意快速地轉(zhuǎn)換，使得耐格里阿米巴成為了解這兩種細(xì)胞運(yùn)動的基本模型[5-7]。值得注意的是，在阿米巴狀態(tài)下除了有絲分裂幾乎所有的細(xì)胞功能都能在沒有微管的情況下實(shí)現(xiàn)，包括120 μm/min的速度爬行。就目前而言，耐格里阿米巴是已知的爬行速度最快的單細(xì)胞，至少是魚類角化細(xì)胞、盤基網(wǎng)柄菌和人類中性粒細(xì)胞的兩倍。來自于其他生物體的微管蛋白抑制劑研究表明這一細(xì)胞快速遷移可能不需要微管，而耐格里阿米巴的生物學(xué)行為更為這一假說提供了相關(guān)的生物學(xué)證據(jù)[8]。從阿米巴狀態(tài)分化到鞭毛體狀態(tài)涉及重新組裝一個(gè)完整的微管骨架，包括兩個(gè)基體、兩到四根鞭毛和整個(gè)皮層的微管陣列的組裝，以及新的微管細(xì)胞骨架與先前存在的肌動蛋白骨架之間的協(xié)調(diào)。在分子層面上，分化過程也涉及在60～90 min內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯包括微管在內(nèi)的所有細(xì)胞骨架成分。該分化過程很容易同步，90%以上的細(xì)胞5～10 min能夠重新組裝基體，而哺乳動物細(xì)胞需要24 h才能重新組裝中心粒[9-10]。目前由于不能對該物種進(jìn)行遺傳水平操作以及相關(guān)基因操作，這給后續(xù)研究帶來十分大的困擾。2010年，耐格里阿米巴的全基因組測序給研究早期真核生物的進(jìn)化提供了新的視角，并為阿米巴生物學(xué)研究開辟了意想不到的途徑，這或許能夠使得耐格里阿米巴從非經(jīng)典模式生物轉(zhuǎn)變?yōu)闊衢T的經(jīng)典模式生物。

1 耐格里阿米巴的分化

1957年，Waddington提出假說：在正常情況下，干細(xì)胞按照預(yù)定的程序分化形成終末端已分化的細(xì)胞，但在特定的情況下，細(xì)胞也可以通過重編程重新進(jìn)入未分化的狀態(tài)或者轉(zhuǎn)分化為另一類型細(xì)胞[11]。分化并不是多細(xì)胞生物所特有的，嚴(yán)格意義上多細(xì)胞真核生物的分化來自于單細(xì)胞真核生物分化的繼承。早在10億年前，單細(xì)胞真核生物誕生之初，分化就開始了。在單細(xì)胞真核生物生活史中，不同階段下的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生命活動以及功能是不一樣的。瘧原蟲在按蚊體內(nèi)以子孢子形式存在于按蚊的唾液里面，隨著按蚊叮咬病人注射入血液中，在肝臟中變成裂殖體，最后入侵紅細(xì)胞又會變成環(huán)狀體[12]。耐格里阿米巴生活史包括阿米巴形態(tài)、鞭毛體和胞囊等3個(gè)階段，對應(yīng)著3種完全不同的細(xì)胞形態(tài)[圖1(a)]。其中，從阿米巴形態(tài)變?yōu)楸廾w形態(tài)的過程被稱為分化(differentiation)或轉(zhuǎn)化(transformation)，可以在低滲溶液和振蕩條件下被誘導(dǎo)發(fā)生，且整個(gè)過程快速而均一。當(dāng)分化環(huán)境溫度為28 ℃時(shí)，30 min左右鞭毛體形態(tài)開始出現(xiàn)，60 min左右即有90%以上的細(xì)胞進(jìn)入鞭毛體形態(tài)，在實(shí)驗(yàn)條件下鞭毛體形態(tài)維持30 min左右就會緩慢地變回阿米巴形態(tài)[圖1(b)]。鞭毛體是一個(gè)短暫而不穩(wěn)定的細(xì)胞狀態(tài)，在誘導(dǎo)后會自發(fā)返回阿米巴形態(tài)，且在該階段不能進(jìn)食和細(xì)胞分裂[1]。

在食物匱乏的情況下，阿米巴形態(tài)可以緩慢變化，在細(xì)胞周圍分泌形成一層堅(jiān)硬的胞囊壁，以胞囊形態(tài)度過艱難的環(huán)境。而在環(huán)境中存在水和食物時(shí)，細(xì)胞又可以從胞囊壁中萌發(fā)，重新形成阿米巴。在所有3種細(xì)胞形態(tài)中，只有阿米巴形態(tài)能進(jìn)食細(xì)菌，并通過有絲分裂進(jìn)行增殖[圖1(a)]。

(a)表示耐格里阿米巴生活史不同階段的3個(gè)不同形態(tài)和相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，圖中箭頭表示移動方向；阿米巴狀態(tài)和鞭毛體狀態(tài)下能夠移動，胞囊狀態(tài)不能移動，但可通過胞囊孔感知外界環(huán)境。(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分化條件：2 mmol/L Tris pH 7.4，密度1.4×106個(gè)/mL(NEG), 0.7×106個(gè)/mL(NEG-M)，溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速：87 r/min；NEG-M是二倍化的NEG，可以在液體培養(yǎng)基中生長，無需細(xì)菌為食

當(dāng)耐格里阿米巴開始分化時(shí)，它們停止阿米巴形態(tài)下的運(yùn)動并聚集起來。一對短鞭毛首先開始出現(xiàn)在球形細(xì)胞上并繼續(xù)伸長，直到長度達(dá)到大約15 μm，同時(shí)細(xì)胞由球形變?yōu)榧?xì)長[1,13]。這一生物學(xué)過程涉及了肌動蛋白纖維的重排、細(xì)胞質(zhì)微管的生物學(xué)合成與組裝以及基體的合成，等等[9-10]。耐格里阿米巴可以維持鞭毛體形態(tài)幾分鐘、幾個(gè)小時(shí)或者幾天，這取決于實(shí)驗(yàn)條件，最終它還是會回到阿米巴形態(tài)。在逆轉(zhuǎn)過程中，鞭毛體失去了它的規(guī)則形狀，變成了帶有鞭毛的變形蟲隨后鞭毛停止移動，進(jìn)而被吸收到細(xì)胞體中。在這種分化過程中，DNA合成會停止，有絲分裂也不會進(jìn)行，但是細(xì)胞可以繼續(xù)進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)合成。已知的幾個(gè)會引發(fā)分化的因素包括生長溫度的降低，暴露于水環(huán)境、饑餓、低電解質(zhì)濃度和振蕩攪拌。盡管這些因素誘導(dǎo)其分化的機(jī)制尚不清楚，但是耐格里阿米巴能夠感覺到刺激信號的強(qiáng)弱程度并決定是否完成分化。如果一個(gè)細(xì)胞被微弱的信號刺激，細(xì)胞仍然會啟動分化過程，但這種分化會停止在一個(gè)特定的細(xì)胞狀態(tài)，這個(gè)狀態(tài)被稱為保持點(diǎn)(hold point)。在保持點(diǎn)，細(xì)胞保持部分分化的狀態(tài)，如果處于保持點(diǎn)的細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)收到額外的信號，它們又將繼續(xù)分化。Fulton等[14]發(fā)現(xiàn)啟動分化后的10 min和20 min是兩個(gè)比較關(guān)鍵的保持點(diǎn)。

在耐格里阿米巴分化過程中，細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)做出了重大改變，包括肌動蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)的重排與解聚、微管的生物學(xué)合成與組裝、鞭毛的形成、細(xì)胞形態(tài)的改變、基體的重新合成和相關(guān)控制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而這一切都在短短的60 min內(nèi)就完成了。它是如何在短時(shí)間內(nèi)協(xié)調(diào)內(nèi)部遺傳機(jī)制對這一環(huán)境刺激作出適應(yīng)性改變，這深深吸引了相關(guān)研究學(xué)者的興趣。Han等[15]指出α-微管蛋白、β-微管蛋白、鞭毛鈣調(diào)蛋白和1類mRNA，在轉(zhuǎn)錄啟動后會立即在分化細(xì)胞的外圍共同定位。當(dāng)50%的細(xì)胞處于鞭毛體狀態(tài)時(shí)，這些mRNA則出現(xiàn)在細(xì)胞鞭毛生長的基底部。在鞭毛和細(xì)胞質(zhì)微管的伸長過程中，這些mRNA移動到鞭毛細(xì)胞的后端，然后消失。在分化開始時(shí)，添加細(xì)胞松弛素D會抑制這些mRNA的共定位。這種處理并不影響mRNA的瞬時(shí)積累和翻譯，但它們卻抑制了鞭毛的形成[15-16]。另外還有研究發(fā)現(xiàn)，γ-微管蛋白、NgSAS6和NgPlk4與微管蛋白mRNAs共同定位也依賴于肌動蛋白。這些數(shù)據(jù)表明，這些mRNAs在同一點(diǎn)的定位和翻譯是基體和鞭毛快速形成的重要基礎(chǔ)[17]。Fulton等[18]通過對上述4類蛋白mRNA的Southern Blot發(fā)現(xiàn)，這4類mRNA表達(dá)量隨時(shí)間變化十分一致，即都在分化后的40 min到達(dá)高峰，隨后緩慢降低且表達(dá)量高低也呈現(xiàn)高度一致。隨后，作者在這4類基因的啟動子上游區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一段保守回文序列，這段12核苷酸序列是5′-TTTGGCGCCAAA-3′，不同基因這段序列會有一到兩個(gè)核苷酸差異。他們推測這段回文序列可能是某個(gè)潛在的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，用于調(diào)控這類基因的協(xié)同表達(dá)。通過回文序列調(diào)控基因的協(xié)同表達(dá)常見于原核生物如半乳糖操縱子，是否在真核生物上存在還沒有被證明。這可能是耐格里阿米巴能夠在短時(shí)間內(nèi)從阿米巴形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楸廾w形態(tài)的重要原因和依據(jù)。

2 耐格里阿米巴基因組結(jié)構(gòu)及進(jìn)化地位

2.1 耐格里阿米巴基因組

耐格里阿米巴包含15 727個(gè)基因，基因組由14 kb染色體外質(zhì)粒(NCBI accession AB298288.1)、50 kb線粒體基因組(GenBank accession AF288092.1)以及線性核染色體組成。脈沖凝膠電泳分析表明，耐格里阿米巴至少有12條染色體，大小在0.7到6.5 Mb之間，共計(jì)約42 Mb，其中重復(fù)序列僅占5.1%。它整個(gè)基因組的GC含量為33%，其中人類是41%而衣藻高達(dá)64%。由于其基因組只有約42 Mb卻編碼15 727個(gè)基因，這表明它絕大部分都是編碼序列并且相對于復(fù)雜的真核生物來說沒有過多的重復(fù)序列以及冗余序列。平均每個(gè)基因的內(nèi)含子(intron)數(shù)量是0.7，很多基因沒有內(nèi)含子或者只有一個(gè)內(nèi)含子，而人類平均每個(gè)基因卻有高達(dá)7.8個(gè)內(nèi)含子。這些特征總體來說表明阿米巴的基因組在進(jìn)化上還處于很原始的地位[19-20]。

2.2 耐格里阿米巴線粒體基因組

耐格里阿米巴線粒體基因組大小約50 kb，在單個(gè)環(huán)形的基因組上包含49 843個(gè)堿基對，編碼67個(gè)蛋白質(zhì)。相對于其他原生生物，它具有更多編碼線粒體復(fù)合物Ⅰ亞基的基因，同時(shí)它還含有編碼細(xì)胞色素c和tRNA的基因，這些特征表明在線粒體功能上耐格里阿米巴具有一定的復(fù)雜性。最后，耐格里阿米巴被報(bào)道為植物界以外第一個(gè)含有參與植物細(xì)胞RNA編輯的DYW型五肽重復(fù)序列(PPR)同源蛋白的生物體[21]，線粒體基因組序列分析沒有直接表明RNA編輯和反式剪接對于線粒體基因表達(dá)具有必要性。根據(jù)與其他真核細(xì)胞的相似性研究，耐格里阿米巴也含有大量非DYW型PPR蛋白。因此，其線粒體基因組序列既有教科書式的基本代謝元素又加入了一些不同尋常的特征，總體上描繪了JEH(Jakobids-Euglenozoans-Heteroloboseans)類群生物線粒體復(fù)雜的進(jìn)化圖景。

2.3 耐格里阿米巴染色體外質(zhì)粒

真核生物有多種方式維持rRNA的高表達(dá)，如人類基因組上有多個(gè)rRNA(核糖體RNA)的基因拷貝，而耐格里阿米巴在染色體上并沒有發(fā)現(xiàn)任何rRNA基因。Clark等[22]發(fā)現(xiàn)在染色體外的核仁結(jié)構(gòu)區(qū)存在著大約14 kb大小的環(huán)形質(zhì)粒，質(zhì)?？截悢?shù)在4 000左右，每個(gè)質(zhì)粒均攜帶一份18 s、5.8 s和28 s rRNA基因拷貝。這就意味著每個(gè)阿米巴細(xì)胞攜帶著4 000個(gè)拷貝的rRNA基因，這暗示其細(xì)胞內(nèi)有豐富的蛋白表達(dá)和翻譯體系。Mullican等利用中性二維凝膠電泳的方式發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)定位在一段2.1 kb的序列內(nèi)。其結(jié)果表明，rDNA質(zhì)粒的復(fù)制是通過θ型復(fù)制模式而不是通過滾動循環(huán)模式(Rolling circle mode)從單個(gè)原點(diǎn)復(fù)制，而且G-四鏈體元件和重復(fù)序列這些DNA復(fù)制源的特征序列也在該片段附近。另外，這個(gè)質(zhì)粒還有兩個(gè)功能未知的開放閱讀框，其中一個(gè)編碼173個(gè)氨基酸，與任何其他已知蛋白序列沒有相似性，另外一個(gè)編碼376個(gè)氨基酸，與歸巢核酸內(nèi)切酶有一定同源性[23]。

3 耐格里阿米巴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝的多樣性

3.1 耐格里阿米巴代謝多樣性

像許多真核微生物一樣，耐格里阿米巴通過Krebs循環(huán)和支鏈線粒體呼吸鏈氧化葡萄糖、各種氨基酸和脂肪酸。然而耐格里阿米巴也同時(shí)具有復(fù)雜的無氧代謝能力，包括：底物水平磷酸化，常見于微需氧真核生物如賈第鞭毛蟲和毛滴蟲；使用延胡索酸作為最終電子受體的能力；編碼鐵氫還原酶及相關(guān)成熟系統(tǒng)[24]。耐格里阿米巴的有氧和無氧代謝能力與另外一種土壤和池塘居住的生物衣藻十分相似，這些原生生物可能利用他們的代謝靈活性來適應(yīng)泥濘環(huán)境中常見的間歇性缺氧環(huán)境[25]。令人驚訝的是，除了整套鐵氫還原酶之外，這些蛋白N-末端有線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這表明耐格里阿米巴的線粒體具有產(chǎn)生氫氣的功能。由于鐵氫還原酶是一種氧氣敏感性酶，這說明在有氧條件下它們正常進(jìn)行TCA循環(huán)，在缺氧的條件下它們能夠通過產(chǎn)生氫氣進(jìn)行能量代謝。這一發(fā)現(xiàn)為線粒體起源的氫假說提供了新的支持，即線粒體的內(nèi)共生祖先同時(shí)具有厭氧和需氧途徑。在真核生物適應(yīng)有氧或無氧生態(tài)位的過程中，這些途徑被選擇性地丟失，導(dǎo)致只能進(jìn)行TCA循環(huán)的線粒體或氫生物小體的形成。然而迄今為止，在任何當(dāng)代真核生物中還沒有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有這兩種代謝方式的線粒體[26-27]。

3.2 耐格里阿米巴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多樣性

耐格里阿米巴基因組大小只有41 Mb，但是卻編碼多達(dá)15 727個(gè)基因，這些基因編碼了一系列廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，進(jìn)而造就了耐格里阿米巴復(fù)雜的生物學(xué)行為，包括3種形態(tài)的切換及分化、外界環(huán)境的感知、豐富的級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路甚至寄生等。舉例來說，耐格里阿米巴有30種推測的組氨酸激酶和6種相應(yīng)的受體蛋白，然而這在布氏錐蟲和內(nèi)寄生性阿米巴中是不存在的。它還有近300種G蛋白偶聯(lián)受體和相關(guān)信號通路蛋白，這在賈第鞭毛蟲和布魯氏桿菌中是缺失的[28-29]。許多生物體通過膜結(jié)合的腺苷酸/鳥苷酸環(huán)化酶來感知外界環(huán)境，耐格里阿米巴至少含有108個(gè)環(huán)化酶，這幾乎是人類基因組中發(fā)現(xiàn)的2倍(環(huán)化酶如此豐富的原因依然令人費(fèi)解)。此外，耐格里阿米巴基因組中近一半的蛋白含有PAS信號感知區(qū)域，4個(gè)與NIT結(jié)構(gòu)域配對，這些區(qū)域則是被細(xì)菌用來檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度的[30]。其中4種環(huán)化酶也有BLUF結(jié)構(gòu)域，是眼蟲產(chǎn)生光響應(yīng)行為的結(jié)構(gòu)域組合，可能耐格里阿米巴有細(xì)微的光響應(yīng)行為或者使用BLUF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氧化還原感應(yīng)[31]?？傮w來說，耐格里阿米巴豐富的組氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)受體、腺苷酸/鳥苷酸環(huán)化酶、GTP激酶等可以參與豐富的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是它適應(yīng)各種不同環(huán)境以及感知外界變化的結(jié)果，也是它豐富又復(fù)雜的生物學(xué)行為的基礎(chǔ)(圖2)。

組氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體在多數(shù)寄生蟲中缺失，而在耐格里阿米巴中特有。Histidine kinases:組氨酸激酶；GPCRs:G蛋白偶聯(lián)受體；Second messengers:第二信使；PIP2：磷脂酰肌醇二磷酸；PIP3：磷脂酰肌醇三磷酸；PTEN：磷酸脂酶；Ras GTPases: Ras GTP酶

4 耐格里阿米巴進(jìn)化地位

10億年前所有的真核生物都有一個(gè)共同祖先，隨后在進(jìn)化上它們至少分化為6個(gè)主要類群，耐格里阿米巴是JEH(Jakobids-euglenozoans-heteroloboseans)類群生物的一個(gè)代表，在進(jìn)化樹上較為靠近真核生物最近的共同祖先(Last common eukaryotic ancestor，LCEA)(圖3)。這種進(jìn)化的古老特征還體現(xiàn)在該物種擁有較為原始的有絲分裂方式——原有絲分裂(Promitosis)，分裂過程中核膜和核仁都不解體消失，其中核仁在分裂后期和末期會移動到兩級并形成被稱為中間體(Interzonal body)的結(jié)構(gòu)[1]。JEH類群生物代表性的3個(gè)類群是眼蟲、錐蟲和阿米巴，其中多數(shù)是具有寄生性的如布氏錐蟲、陰道毛滴蟲和福氏耐格里阿米巴。而Naegleriagruberi沒有寄生性，這為研究寄生蟲寄生機(jī)制提供了方便性。在寄生蟲的生活史中也常常伴隨著形態(tài)和結(jié)構(gòu)功能的轉(zhuǎn)變，以適應(yīng)不同宿主體內(nèi)的環(huán)境。耐格里阿米巴基因組測序的完成，首次允許比較這6個(gè)主要真核生物類群非還原基因組的完整序列。分析表明，真核生物的共同祖先擁有超過4 000個(gè)基因，這些基因仍然存在于現(xiàn)存的真核生物中，其中40%是真核生物譜系中的新基因，因?yàn)樗鼈冊诠派蚣?xì)菌中沒有可識別的同源物。許多真核特異性的祖先基因家族至今還沒有明確的功能。這些基因序列可能是早期真核生物在進(jìn)化上適應(yīng)的特征序列，包括大量內(nèi)含子、復(fù)雜的DNA和RNA代謝、廣泛的代謝和信號通路以及變形和鞭毛運(yùn)動[19]。

Last common eukaryotic ancestor:真核生物最近共同祖先；紅色加粗表示耐格里阿米巴；黑色加粗表示研究較多的單細(xì)胞真核生物與耐格里阿米巴在進(jìn)化上的親緣關(guān)系

5 小結(jié)與展望

耐格里阿米巴作為非經(jīng)典模式生物目前還不能進(jìn)行遺傳水平操作和基因編輯，這極大地限制了相關(guān)生物學(xué)研究。但是它作為原始真核生物共同祖先最具代表性的一群JEH，身上同時(shí)具有原始與進(jìn)化的特征，又由于其生活的環(huán)境多樣性以及可能接受多種外界信號刺激，它本身呈現(xiàn)出復(fù)雜的生物學(xué)功能和對外界環(huán)境刺激的敏感性。如在28 ℃的條件下，在30 min時(shí)間點(diǎn)就檢測到了鞭毛體的存在。另外，在阿米巴狀態(tài)下被UV照射10 s左右，它就會收縮偽足形成橢圓球狀體，這可能是因?yàn)樗w內(nèi)存在UV等電磁波的受體，或者UV產(chǎn)生的某些損傷被它感受到了。對于重要的最基本的生命活動，生物都具有高度保守性，通過這一保守性可以發(fā)現(xiàn)某些生物學(xué)功能進(jìn)化規(guī)律和研究生物的進(jìn)化。由此可見，耐格里阿米巴作為溝通原核生物與真核生物的橋梁，在其身上或許會有很多令人意外的發(fā)現(xiàn)。例如對阿米巴是如何感知外界環(huán)境變化并分化的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)耐格里阿米巴有著豐富的組氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)受體和腺苷酸/鳥苷酸環(huán)化酶，這些蛋白組成了豐富而又迅捷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，為阿米巴在短時(shí)間內(nèi)完成分化提供了基礎(chǔ)[13]。研究發(fā)現(xiàn)在阿米巴中，參與分化的相關(guān)基因能夠通過利用肌動蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)共定位在基體附近，這樣能夠維持基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯。除此之外，這些基因前面的回文序列可能類似于通過操縱子一樣的調(diào)控機(jī)制，使得這些基因的mRNA協(xié)同表達(dá)，為其快速分化提供幫助[31]。這一復(fù)雜分化調(diào)控機(jī)制使得耐格里阿米巴僅在60 min內(nèi)就能夠完成分化這一過程，而在多細(xì)胞真核生物中的細(xì)胞分化，如造血干細(xì)胞的分化等往往需要幾天的時(shí)間。也可以看到，阿米巴擁有經(jīng)典的染色體，但是在核仁區(qū)域內(nèi)部是大約4 000個(gè)拷貝的rDNA質(zhì)粒，負(fù)責(zé)快速產(chǎn)生大量18 s RNA、5.8 s RNA和28 s RNA，這些RNA最終將組裝形成為數(shù)眾多的核糖體用于蛋白的表達(dá)翻譯[15-16]。耐格里阿米巴的rDNA有大約4 000個(gè)拷貝，可以通過裂解核膜分離核仁來得到rDNA，將它改造成為一個(gè)穿梭質(zhì)粒從而啟動外源基因在阿米巴上的表達(dá)。由于耐格里阿米巴生活在灘涂淤泥和水環(huán)境里，常常是無氧或者缺氧的，那么擁有無氧代謝能力是十分重要的，這里它展現(xiàn)出原始的一面，在線粒體內(nèi)部通過鐵氫還原酶在缺氧環(huán)境下直接將質(zhì)子還原形成氫氣。同樣衣藻也能夠產(chǎn)氫，但它是通過葉綠體產(chǎn)氫，而耐格里阿米巴則是通過線粒體來完成。迄今為止，除阿米巴之外，在任何當(dāng)代真核生物中還沒有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有這兩種代謝方式的線粒體[26-27]。

分化往往伴隨著全基因甲基化水平的改變。以小鼠胚胎發(fā)育就經(jīng)歷兩次大規(guī)模全基因甲基化重排，癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化也呈現(xiàn)不同的全基因組甲基化圖譜[32-33]。那么在耐格里阿米巴分化過程中，是否有全基因組甲基化水平的變化呢？DNA甲基化的建立與擦除主要與DNMT1(DNA(cytosine-5)-methyltransferase1)和TET(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase)蛋白有關(guān)，其中TET蛋白負(fù)責(zé)DNA甲基化的擦除。通過同源序列比對，研究者發(fā)現(xiàn)耐格里阿米巴有8個(gè)TET同源蛋白。2014年程曉東實(shí)驗(yàn)室解析出NgTET1的結(jié)構(gòu)，該蛋白的酶活催化結(jié)構(gòu)域在耐格里阿米巴和哺乳動物之間是保守的。然而為什么耐格里阿米巴需要如此多的TET同源蛋白存在，以及這些TET蛋白在該物種中是否發(fā)揮著其他的功能引起了眾多科研工作者的興趣[34]。另外，衣藻的TET同源蛋白CMD1能夠在衣藻基因組DNA上產(chǎn)生5gmC修飾，這一修飾對于衣藻的強(qiáng)光感應(yīng)調(diào)節(jié)尤為重要[35]。這說明在進(jìn)化上TET蛋白家族曾經(jīng)發(fā)揮著不同的功能，目前在耐格里阿米巴身上還沒有相關(guān)研究。值得一提的是：耐格里阿米巴在實(shí)驗(yàn)體系下沒有發(fā)現(xiàn)有性生殖的現(xiàn)象，但在其基因組中存在減數(shù)分裂所需的所有基因。這些減數(shù)分裂基因都具有較高的表達(dá)，且部分基因在分化過程中有明顯的上調(diào)，比如Hop1/2、Msh4/5等基因。如果它沒有有性生殖，那這些減數(shù)分裂基因的功能是什么？如果有有性生殖，那它的有性生殖方式會不會比較特殊，導(dǎo)致至今尚未發(fā)現(xiàn)？相信二代三代測序技術(shù)的發(fā)展以及針對DNA修飾的測序?qū)o探索表觀遺傳調(diào)控帶來新的突破。另外，以Cas9蛋白為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)可能能夠首次實(shí)現(xiàn)阿米巴的遺傳水平操作，能夠在DNA分子水平研究阿米巴的生物學(xué)特征和功能。

耐格里阿米巴屬于單細(xì)胞真核生物，易于研究和培養(yǎng)，在進(jìn)化地位上既有早期真核生物的原始特征又有現(xiàn)代真核生物的特征，它的分化具有高度同步性和一致性，潛在豐富的DNA修飾蛋白又暗示著它的DNA修飾調(diào)節(jié)多樣性。線粒體同時(shí)具有無氧代謝和有氧代謝的功能。另外，它的基因組中包含有性生殖相關(guān)基因，但目前在實(shí)驗(yàn)室條件下還沒有發(fā)現(xiàn)它能發(fā)生有性生殖?？傊?，耐格里阿米巴有諸多令人感興趣的地方，還有待進(jìn)一步發(fā)掘。