王 玨，胡麗麗，張育敏，吳 娜，李 睿

(山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030600)

天然蛋白由于性能的局限性，在一些反應(yīng)中有所限制，故須對(duì)目的蛋白進(jìn)行改造，以優(yōu)化相關(guān)活性或穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的方法包括理性設(shè)計(jì)點(diǎn)突變及定向進(jìn)化技術(shù)引入隨機(jī)突變[1-2]。這兩種技術(shù)也并不獨(dú)立，很多學(xué)者通過(guò)結(jié)合目標(biāo)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)定向進(jìn)化得到的隨機(jī)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，可篩選出對(duì)于目的基因改造更有意義的突變位點(diǎn)，從而打破進(jìn)化瓶頸，實(shí)現(xiàn)改造蛋白多種性能的目標(biāo)[3]。

RML是源于真菌米黑霉的脂肪酶，其全基因序列包括24個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽，70個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)肽以及269個(gè)氨基酸組成的成熟區(qū)3部分，其中前導(dǎo)肽位于成熟區(qū)的N端，主要作用是幫助目標(biāo)蛋白正確折疊[4]。成熟的RML可催化甘油三酯為甘油二酯，為工業(yè)油脂的改良所應(yīng)用。但由于其來(lái)源于嗜溫微生物，在高壓高溫等環(huán)境中不穩(wěn)定、易失活，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[5]，因此，對(duì)RML熱穩(wěn)定性的改造顯得尤為重要。近年來(lái)人們也開始通過(guò)氨基酸序列突變結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)模擬來(lái)預(yù)測(cè)突變對(duì)于蛋白熱穩(wěn)定性的影響[6]，有關(guān)RML熱穩(wěn)定性研究的最新報(bào)道是通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬對(duì)RML成熟區(qū)(不包括前導(dǎo)肽)進(jìn)行定點(diǎn)突變及二硫鍵的設(shè)計(jì)，得到的突變體半衰期比野生型提高了12.5倍(70 ℃處理下)[7]。前期工作證明，前導(dǎo)肽突變對(duì)RML活性有影響[8]，因此，包含前導(dǎo)肽的全基因進(jìn)化為蛋白性能的改造拓展了基因研究范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 RML全基因序列與pET30a構(gòu)建的重組質(zhì)粒，命名為pET30a-pro-RML，用作第一輪定向進(jìn)化中易錯(cuò)PCR的模板；大腸桿菌BL21，制備感受態(tài)細(xì)胞。

1.1.2 工具酶 T4 DNA連接酶；TaqDNA聚合酶；限制性內(nèi)切酶NcoI、Hind III購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.3 試劑 細(xì)胞裂解液(用于96孔細(xì)菌培養(yǎng)板上裂解細(xì)胞釋放酶液)；酚酞指示劑(用于酸堿滴定檢測(cè)酶活指示)；Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液(用于制備超級(jí)感受態(tài))。

1.1.4 設(shè)備與耗材 PCR儀，超聲破碎儀，堿式滴定管，蛋白純化儀，恒溫(可低溫)搖床，冷凍離心機(jī)，凝膠成像系統(tǒng)，96微孔培養(yǎng)板，質(zhì)粒提取試劑盒，凝膠純化試劑盒，Quick change定點(diǎn)突變?cè)噭┖械取?/p>

1.2 方法

1.2.1 易錯(cuò)PCR與突變體文庫(kù)的建立 易錯(cuò)PCR(體系加入Mn2+)上游引物: 5′-CGCGCCATGGTGCCAATCAAGAGACAATC-3′(包括酶切位點(diǎn)NcoI)；下游引物:5′-GCCGAAGCTTAAGTACAGAGGCCTGTGT-3′(包括酶切位點(diǎn)Hind III)。帶有隨機(jī)突變的RML全基因與pET30a進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，獲得大量重組子。

1.2.2 RML脂肪酶突變體的誘導(dǎo)表達(dá) 將1.2.1轉(zhuǎn)化所得突變體文庫(kù)的單菌落逐一接于96孔培養(yǎng)板中(此板命名為母板)，于37 ℃，12～16 h培養(yǎng)后以2%的接種量將母板中的菌液對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)接入一塊新的96孔培養(yǎng)板(此板命名為子板)。將轉(zhuǎn)接后的菌液37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)(IPTG終濃度為0.1 mmol/L)。誘導(dǎo)4 h后，離心收集子板菌體。將子板放入-80 ℃冷凍12 h以上，取出后每個(gè)培養(yǎng)孔中加入250 μL的細(xì)胞裂解液，放置于37 ℃ 1～2 h，使菌體裂解，目標(biāo)蛋白釋放在細(xì)胞裂解液中。具體方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 突變體熱穩(wěn)定性的初篩 研究采用一種新型高效的用于脂肪酶高通量篩選的方法[10],該方法選擇油酸作為真實(shí)底物，通過(guò)指示劑的顏色變化，觀察酶活性高低。篩選時(shí)，先將酶液置于70 ℃保溫2 h，再進(jìn)行活性鑒定。注意使用野生型酶液做對(duì)照。

1.2.4 突變體熱穩(wěn)定性的復(fù)篩 圖1為野生型RML純化前后的SDS-PAGE圖，分別在37 ℃和16 ℃下誘導(dǎo)，可看出低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量更高[11]，因此最終選擇16 ℃為每個(gè)蛋白樣品的復(fù)篩誘導(dǎo)條件。蛋白純化利用Ni柱與載體pET30a的蛋白標(biāo)簽His-tag親和進(jìn)行純化。以野生型蛋白為例，將1.2.3方法中通過(guò)高通量初篩得到的每個(gè)優(yōu)勢(shì)突變體都按照與野生型相同的誘導(dǎo)及純化條件進(jìn)行操作。試驗(yàn)采用堿滴定法測(cè)定純蛋白的比活進(jìn)行復(fù)篩。酶活定義為：酶分子每分鐘催化底物(油脂)釋放出1 μmol脂肪酸的酶量為1個(gè)脂肪酶活力單位(U)，具體蛋白質(zhì)比活計(jì)算公式如下：

M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1: 37 ℃誘導(dǎo)RML表達(dá)情況；2: 37 ℃ RML表達(dá)純化結(jié)果；3：16 ℃誘導(dǎo)RML表達(dá)情況；4：16 ℃ RML 表達(dá)純化結(jié)果

式中：V代表滴定反應(yīng)體系(加酶液后)所消耗的NaOH溶液體積(mL)；V0代表滴定空白體系(無(wú)酶液)所消耗的NaOH溶液體積(mL)；t代表反應(yīng)時(shí)間(min)；n代表酶液體積(純化后)(mL)；M代表滴定用的NaOH溶液的濃度(mmol/L)(注：研究表示蛋白催化活性單位為U/mg，即需測(cè)定蛋白濃度，換算所得)。

1.2.5 定點(diǎn)突變和定點(diǎn)飽和突變 研究采用Quick-Change定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，根?jù)RML定向進(jìn)化得到的隨機(jī)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相關(guān)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變和定點(diǎn)飽和突變，分別包括168位氨基酸定點(diǎn)突變，48位、67位、240位、311位以及313位氨基酸定點(diǎn)飽和突變。其中擴(kuò)增目標(biāo)突變體所需的上下游擴(kuò)增引物見表1(其中311位和313位氨基酸相隔較近，故設(shè)計(jì)一對(duì)定點(diǎn)飽和突變引物)。

表1 用于定點(diǎn)突變和飽和突變的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 RML基因突變結(jié)果

通過(guò)2輪易錯(cuò)PCR、2次定點(diǎn)突變和4次定點(diǎn)飽和突變，共得到9株活性和耐熱性有不同程度提高的突變體，試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程如圖2和圖3所示。

①：第一輪定向進(jìn)化；②：第二輪定向進(jìn)化

如圖2所示，研究以野生型RML全基因?yàn)槟０?，進(jìn)行第一輪易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化，得到2株熱穩(wěn)定性有明顯提高的突變體，分別為M1：L57V/S168P和M2：D48V/V67A/T311S。將M1上的突變點(diǎn)S168P通過(guò)定點(diǎn)突變構(gòu)建在突變體M2上(研究人員單獨(dú)對(duì)57位和168位突變點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)L57V的單點(diǎn)突變體經(jīng)過(guò)熱處理后，幾乎不表現(xiàn)活性，故選擇放棄該突變點(diǎn))，得到突變體M3：D48V/V67A/S168P/T311S；然后以M3的重組基因?yàn)槟０?，進(jìn)行第二輪易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化，得到突變體M4：D48V/V67A/S168P/F240S/T311S和M5：D48V/V67A/S168P/T311S/D313H，都表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性；之后將M4上的突變點(diǎn)F240S和M5出現(xiàn)的突變點(diǎn)D313H通過(guò)定點(diǎn)突變結(jié)合，得到突變體M6：D48V/V67A/S168P/F240S/T311S/D313H。

由圖3所示，從突變體M6出發(fā)，選擇兩輪定向進(jìn)化出現(xiàn)的突變點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，包括兩個(gè)位于前導(dǎo)肽的突變點(diǎn)(48位和67位)，以及3個(gè)位于RML成熟區(qū)的突變點(diǎn)(240位、311位及313位)，分別得到突變體M7：D48V/A67D/S168P/F240ST311S/D313H，M8：D48V/V67A/S168P/S240A/T311S/D313H，M9：D48V/V67A/S168P/S240A/S311C/D313H，相對(duì)M6而言，都表現(xiàn)為更高的熱穩(wěn)定性，其中以M9最佳(168位氨基酸出現(xiàn)脯氨酸置換，根據(jù)脯氨酸的熱穩(wěn)定性效應(yīng)[12],故不再對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變)。

圖3 從M6菌株出發(fā)，進(jìn)行4輪定點(diǎn)飽和突變流程示意圖

2.2 RML突變體熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

將野生型RML以及蛋白突變體M1-M9放置70 ℃ 2 h進(jìn)行熱處理，檢測(cè)其保留活性，同時(shí)以常溫(37 ℃)酶活做對(duì)比。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。研究證明，通過(guò)2輪定向進(jìn)化、2次定點(diǎn)突變和4輪定點(diǎn)飽和突變，成功提高了RML的熱穩(wěn)定性，從野生型RML到突變體M9，無(wú)論是37 ℃時(shí)的酶活，還是70 ℃熱處理后的酶活，整體都呈現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)。野生型RML經(jīng)熱處理后幾乎不表現(xiàn)活性，而M9經(jīng)熱處理后，保留活性可達(dá)(1 316±31)U/mg(保留38%)。同時(shí)，RML在37 ℃下對(duì)甘油三酯的催化活力從(253±20)U/mg提高到(3 609±100)U/mg，提高了14.3倍。另一方面，M7與M4和M5相比，M7在37 ℃下的蛋白比活較前兩者高，但其熱處理后的穩(wěn)定性有所降低，這個(gè)現(xiàn)象可由Dan S.Tawfik[13]提出的“折衷(trade off)”理論來(lái)解釋，并不是所有突變體在常溫下的活性和熱處理后的活性都是相對(duì)應(yīng)提高的，該學(xué)者指出很多時(shí)候定向進(jìn)化中的突變是不穩(wěn)定的(Destabilizing mutations，△△G>0)，即某些突變點(diǎn)提高蛋白質(zhì)在常溫下的比活是以降低其穩(wěn)定性為代價(jià)。因此，尋找一個(gè)常溫和熱處理后活性都能明顯提高的突變體(M9)就尤為重要。

圖4 RML野生型和9株突變體的比活及熱穩(wěn)定性變化趨勢(shì)

3 討論

3.1 突變位點(diǎn)氨基酸性質(zhì)分析

如表2所示，突變體M1-M9的獲得過(guò)程中，共出現(xiàn)10次不同位點(diǎn)的突變，其中有6次突變都是趨向于向疏水性氨基酸的改變。氨基酸側(cè)鏈從極性變成非極性后與有利于為底物與酶的結(jié)合提供疏水環(huán)境，降低結(jié)合狀態(tài)的自由能，從而有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。又發(fā)現(xiàn)M7比M6熱穩(wěn)定性降低是由于67位氨基酸由疏水性丙氨酸突變?yōu)樗嵝缘奶於彼?，這一系列試驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明定向進(jìn)化過(guò)程中疏水性氨基酸的出現(xiàn)可能對(duì)目的蛋白形成更穩(wěn)定的“內(nèi)核”結(jié)構(gòu)有幫助，從而穩(wěn)定蛋白的整體結(jié)構(gòu)；另一方面，酶分子的疏水性內(nèi)核常常都作為其活性中心域，這也為疏水性氨基酸的出現(xiàn)可提高目的蛋白熱保留活性作出解釋。

表2 突變體 M1-M9突變位點(diǎn)氨基酸性質(zhì)分析

3.2 突變位點(diǎn)氨基酸空間結(jié)構(gòu)分析

圖5(a)是野生型RML的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖(PDB：6QPP)，其中，A點(diǎn)與B點(diǎn)之間為RML前導(dǎo)肽，B點(diǎn)和C點(diǎn)之間為連接區(qū)，C點(diǎn)和D點(diǎn)之間為RML成熟區(qū)的蛋白結(jié)構(gòu)；圖5(b)是突變體M9的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖(http://swissmodel.expasy.org/)，根據(jù)基因研究范圍，該結(jié)構(gòu)含有前導(dǎo)肽和蛋白成熟區(qū)。

數(shù)據(jù)來(lái)源：NCBI，蛋白序列號(hào)6QPP

突變體M9與野生型蛋白的結(jié)構(gòu)同源性較高，因此M9仍具備野生型RML的相關(guān)性能，且可用作氨基酸突變位點(diǎn)的分析。M9的熱穩(wěn)定性得到了明顯提高，其基因包含6個(gè)突變位點(diǎn)：D48V、V67A、S168P、S240A、S311C以及D313H。使用Chimera軟件，對(duì)以上突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6。

圖6(a)顯示48位氨基酸上游是前導(dǎo)肽的α螺旋，48位原Asp被疏水性Val替代，可能有利于區(qū)域結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而疏水作用的增強(qiáng)，有利于α螺旋的穩(wěn)定[14]，因此該位點(diǎn)的突變可能幫助穩(wěn)定了前導(dǎo)肽的α螺旋。圖6(b)顯示67位氨基酸位于前導(dǎo)肽和成熟區(qū)的連接處，其下游是成熟區(qū)蛋白的第一個(gè)β折疊，該位點(diǎn)由Val突變?yōu)锳la，氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)更小，可能使得前導(dǎo)肽和成熟區(qū)相連接區(qū)域的空間位阻更小，而前導(dǎo)肽的主要功能是幫助與其相連的目標(biāo)蛋白正確折疊表達(dá)，因此，以上兩個(gè)位點(diǎn)的突變可能都通過(guò)對(duì)前導(dǎo)肽區(qū)域的優(yōu)化而有利于RML熱穩(wěn)定性的提高。圖6(c)顯

圖6 M9突變位點(diǎn)分析

4 結(jié)論

研究以包含前導(dǎo)肽的RML全基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化技術(shù)，定點(diǎn)突變，定點(diǎn)飽和突變相結(jié)合策略，成功提高了RML的熱穩(wěn)定性，同時(shí)，由于RML可以水解甘油三酯為甘油二酯，從而改良油脂的營(yíng)養(yǎng)和性能，因此這一研究結(jié)果對(duì)工業(yè)生產(chǎn)也具有重要意義。另一方面，通過(guò)基因改造的過(guò)程發(fā)現(xiàn)，往往需要多種方法結(jié)合才能更好地設(shè)計(jì)一條“流暢的通路”以提高目的蛋白的相關(guān)性質(zhì)，而對(duì)于RML前導(dǎo)肽和成熟區(qū)共同進(jìn)化的事實(shí)也為蛋白定向進(jìn)化提供了新的思路和方法。