謝詠梅，汪志凌，王麗媛，高珊，蔡曉唐

（四川大學(xué) 華西第二醫(yī)院兒科出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041）

0 引言

生長(zhǎng)抑素（Somatostatin，SST）與胃動(dòng)素（Motilin，MTL）是經(jīng)典的“抑制性”與“興奮性”胃腸肽代表，對(duì)“胃腸-神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”功能有著廣泛調(diào)節(jié)作用。既往的研究發(fā)現(xiàn)，母乳中有高濃度的SST及MTL分泌，并可能參與嬰兒胃腸功能維護(hù)、抑制過(guò)敏及誘導(dǎo)“食物免疫耐受”[1]。牛乳過(guò)敏癥在嬰幼兒的發(fā)病率呈顯著升高趨勢(shì)，降低牛奶粉的過(guò)敏性研究有著積極的醫(yī)學(xué)及社會(huì)意義。本著模擬母乳原則，本研究在普通嬰兒牛乳奶粉中添加“等同母乳劑量”的SST及MTL，探索添加胃腸肽的奶粉對(duì)“牛乳過(guò)敏癥及食物不耐受”是否有預(yù)防功效及降低風(fēng)險(xiǎn)作用。并了解在添加SST及MTL后的奶粉對(duì)幼崽自身胃腸肽分泌的影響，觀察其有否顯著臨床副作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與干預(yù)處理

采用BN（Brown Norway）大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。BN大鼠于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)。生后一周左右的BN大鼠幼仔，按性別及體重分級(jí)，隨機(jī)分配到3組。每組15只幼鼠，給與不同干預(yù)方式喂養(yǎng)，詳見(jiàn)表1。

添加胃腸肽的牛乳奶粉配置方法：牛乳奶粉按說(shuō)明書(shū)配置成牛乳。牛乳中添加胃動(dòng)素至終濃度為250 ng/L（豬胃動(dòng)素，廣州和為醫(yī)藥科技有限公司），并同時(shí)添加天然14肽生長(zhǎng)抑素至終濃度為400 ng/L（思他寧，瑞士雪蘭諾公司，Laboratoires Serono S.A.）。

1.2 酶聯(lián)免疫法ELISA測(cè)定血總免疫球蛋白E（Total IgE，T-IgE）水平

所有實(shí)驗(yàn)組BN幼鼠在進(jìn)行不同干預(yù)喂養(yǎng)處理后，于第29天以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。抽取靜脈血5 mL，800g離心分離制備血清，-20℃凍存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清T-IgE水平，檢測(cè)過(guò)程按大鼠血清總IgE試劑盒（RapidBioLab,USA）說(shuō)明書(shū)操作。Model 680酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）測(cè)定650 nm吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算檢測(cè)樣本終濃度。

1.3 臨床損害評(píng)分（疊加量化法）

各組大鼠每天觀察狀況，共計(jì)干預(yù)喂養(yǎng)4周。按表2標(biāo)準(zhǔn)，分別進(jìn)行精神行為狀況、消化道癥狀、體重增長(zhǎng)情況及皮疹狀況等臨床癥狀評(píng)分，最后采用“疊加量化法”評(píng)價(jià)總體臨床損害程度。臨床損害總評(píng)分=皮膚損害評(píng)分+消化道癥狀評(píng)分+精神行為損害評(píng)分+體重落后評(píng)分。每周評(píng)分一次，連續(xù)4周動(dòng)態(tài)評(píng)分，評(píng)分越高者臨床損害越重。

1.4 胃腸動(dòng)力檢測(cè)

采用“葡聚糖藍(lán)法”檢測(cè)胃腸動(dòng)力[2]。各組大鼠給予不同干預(yù)方式喂養(yǎng)至28天。第29天禁食禁飲半天后，給予胃管灌入2%葡聚糖藍(lán)-2000（四川省維克奇生物科技有限公司）0.4 mL。半小時(shí)后處死動(dòng)物，測(cè)定“胃排空比率”及“小腸推進(jìn)比”。于賁門及幽門處結(jié)扎胃體出入口，向胃體內(nèi)針管注入蒸餾水3 mL，清洗胃腔，收集胃內(nèi)液體，在620 nm波長(zhǎng)下（Model 680,Bio-Rad Co.,USA），測(cè)定胃內(nèi)色素殘留物吸光度。胃排空比率（%）=（母乳喂養(yǎng)組吸光度的均值/各樣本吸光度）×100%。小腸推進(jìn)比（%）=（幽門括約肌至色素最前端距離/幽門至盲腸始端總距離）×100%。

1.5 酶聯(lián)免疫法測(cè)定血及大便中SST及MTL含量

大便標(biāo)本處理：干預(yù)處理滿4周時(shí)，于處死大鼠前一天收集新鮮大便標(biāo)本，凍存于-80℃保存待檢。取大便標(biāo)本200 mg，加2 mL生理鹽水，100℃煮沸3 min，加入0.1 mol/L鹽酸0.5 mL，超聲勻漿，4℃孵育1～2 h，加入0.1 mol/L NaOH 0.5 mL中和；4℃低溫離心3 000 rpm×30 min，取上清液；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，蛋白液-80℃凍存待檢。

表1 各實(shí)驗(yàn)組干預(yù)處理措施

表2 臨床損害量化評(píng)分表

血液標(biāo)本處理：在處死大鼠前收集動(dòng)脈血標(biāo)本5 mL，加入含有7.5% EDTA二鈉30μL和抑肽酶40μL的聚苯乙烯試管內(nèi)，靜置2 h后，離心3 000 rpm×15 min，離心半徑8 cm，取上清液分離血漿，凍存于-80℃保存。取血漿2 mL，加入2 mL生理鹽水，100℃煮沸3 min，加入0.1 mol/L鹽酸0.5 mL，4℃孵育1～2 h，加入0.1 mol/L NaOH 0.5 mL中和；4℃低溫離心（3 000 rpm）30 min，取上清液；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，蛋白液-80℃凍存待檢。

采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血漿及大便中MTL及SST含量。大鼠胃動(dòng)素ELISA試劑盒及大鼠生長(zhǎng)抑素ELISA試劑盒購(gòu)自上海信裕生物技術(shù)有限公司。檢測(cè)過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。Model 680酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算檢測(cè)樣本終濃度。每份標(biāo)本取2份檢測(cè)2次，最后結(jié)果以檢測(cè)值的均值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0及Graph Pad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多個(gè)組別之間比較，先采用方差分析（F檢驗(yàn)）比較總體差異性，再采用q檢驗(yàn)進(jìn)行各組別之間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血總免疫球蛋白E（Total IgE，T-IgE）水平

ELISA法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠血中總IgE（T-IgE）水平，見(jiàn)表3。在胃腸喂養(yǎng)及皮膚涂抹致敏刺激下，牛乳組的T-IgE水平較母乳組有顯著升高（q=112.40，P＜0.0001），提示牛乳激發(fā)了顯著的過(guò)敏反應(yīng)。牛乳中添加了胃腸肽后，SST+MTL組的T-IgE較之牛乳組有顯著降低（q=77.96，P＜0.0001）。

表3 血總IgE、臨床損害及胃腸動(dòng)力狀況（n=15）

2.2 臨床損害評(píng)分（疊加量化法）

干預(yù)喂養(yǎng)4周后，牛乳組的臨床損害最重，有皮疹、腹瀉、血便、食納減退、體重增長(zhǎng)緩慢等臨床癥狀。SST+MTL組第4周時(shí)的臨床損害狀況顯著輕于牛乳組（q=13.24，P＜0.0001），見(jiàn)表3。SST+MTL組的臨床損害總評(píng)分在每周的評(píng)估中均為最低，見(jiàn)圖1。

嚴(yán)重并發(fā)癥情況：在牛乳喂養(yǎng)及皮膚涂抹誘導(dǎo)致敏下，第4周時(shí)牛乳組有輕中度皮炎及不同程度的腹瀉、便血癥狀，其他組別的總體臨床損害均輕于牛乳組。所有實(shí)驗(yàn)組均未發(fā)生失血性休克、腸梗阻、重癥喘息、死亡等嚴(yán)重并發(fā)癥。

圖1 臨床損害狀況評(píng)分（分值）

2.3 胃腸動(dòng)力檢測(cè)

以母乳喂養(yǎng)組的胃排空值作為基線對(duì)比，牛乳組及SST+MTL組的胃動(dòng)力狀況均低于母乳組（見(jiàn)表3）。牛乳組的胃動(dòng)力最差（vs.母乳組及vs.SST+MTL組，q值分別為16.93及11.51，P＜0.0001）。盡管SST+MTL組的胃動(dòng)力較之母乳組也有降低，但顯著優(yōu)于牛乳組。小腸推進(jìn)比情況，牛乳組的小腸蠕動(dòng)明顯加快，這與牛乳組有明顯腹瀉癥狀相符合（牛乳組vs.母乳組，q=27.30，P＜0.0001）。SST+MTL組的腹瀉癥狀明顯輕于牛乳組，其小腸動(dòng)力狀況也非常接近BF組，兩組間無(wú)顯著差異性（q=0.3513，P=0.9991）。

2.4 血及大便中SST及MTL含量

牛乳組的血SST及血MTL濃度，較之母乳組及SST+MTL組，盡管在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P＜0.0001），但其倍比降幅并不大，僅低下20%左右（見(jiàn)表4及圖2）。較之牛乳組，SST+MTL組的血SST及血MTL濃度均有上升，其水平接近母乳組，且同母乳組

圖2 血及大便中SST及MTL水平的倍比率（比值率）

無(wú)顯著性差異（P＞0.05，見(jiàn)表4）。大便中的SST/MTL濃度，牛乳組顯著低于母乳組及SST+MTL組（P＜0.0001），且倍比降幅顯著，僅約另兩組濃度的30%左右（見(jiàn)表4及圖2）。SST+MTL組的大便中SST/MTL濃度較之牛乳組有顯著提升，且接近母乳組狀況（vs.母乳組，P＞0.05）。

表4 血及大便中SST及MTL含量（ELISA法，n=15）

3 結(jié)果與討論

胃動(dòng)素（MTL）與生長(zhǎng)抑素（SST）是經(jīng)典的興奮性與抑制性胃腸肽類激素代表[3]，有著廣泛的“胃腸/神經(jīng)/免疫”等調(diào)節(jié)作用。二者的大分子前體均有物種差異，但裂解后的活性部分卻高度保守并跨物種[4-5]。SST與MTL在嬰兒期處于生理性低分泌狀態(tài)。而孕晚期及產(chǎn)后乳母的血漿中SST及MTL分泌水平有顯著增高，母乳中也有高濃度的MTL與SST分泌[1,6-7]，但母乳中活性胃腸肽的生理學(xué)功能尚不明確。

本研究采用高過(guò)敏、高IgE反應(yīng)的BN大鼠，牛乳喂養(yǎng)誘導(dǎo)“食物過(guò)敏/食物不耐受”模型[8]，并在牛乳中添加“等同母乳劑量”的SST及MTL，以探討SST/MTL的功能作用。普通牛乳組誘導(dǎo)出了明顯的消化道及皮膚癥狀，且血總IgE水平顯著升高，并有胃動(dòng)力下降、腸蠕動(dòng)過(guò)快的動(dòng)力紊亂現(xiàn)象，提示造模成功。添加SST+MTL后的牛乳組，較之普通牛乳組，血總IgE水平顯著下降約50%，臨床損害評(píng)分也顯著降低約40%。SST+MTL組的胃腸動(dòng)力狀況也更接近母乳組，體重增長(zhǎng)優(yōu)于牛乳組。可見(jiàn)，添加SST+MTL對(duì)牛乳過(guò)敏有確定的預(yù)防作用，且能提高普通牛乳的胃腸道耐受性，改善生長(zhǎng)發(fā)育狀況。SST+MTL組連續(xù)用藥4周，無(wú)明顯副作用顯現(xiàn)。SST/MTL的含量測(cè)定顯示，牛乳組血中的SST/MTL濃度較母乳組有輕度降低，但消化道局部（大便中）的SST/MTL的含量明顯低下而缺乏。添加SST+MTL后，消化道局部?jī)?nèi)的濃度提升顯著（約3倍），更接近母乳組狀況，而血循環(huán)中濃度提升則非常輕微（僅20%左右，見(jiàn)圖2）。這顯示，食物中添加SST/MTL更多的是在胃腸道局部起作用，對(duì)幼崽的自身血循環(huán)系統(tǒng)中的胃腸肽水平影響較小。

SST是經(jīng)典的抑制性胃腸激素代表，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育及胃腸功能均有抑制作用[9]。15年前就發(fā)現(xiàn)，嬰兒期血中SST水平較成人顯著低下（約1/4比例），但嬰兒的胃腸道黏膜上“SST受體”表達(dá)卻十分豐富，這種“受體與配體不平衡”的奇怪表達(dá)現(xiàn)象，其生理學(xué)意義未知[10]。進(jìn)場(chǎng)我們又發(fā)現(xiàn)，母乳中有豐富的SST分泌，約4倍于人血濃度[1,6-7]，母乳中高濃度的SST應(yīng)該不是為了抑制嬰兒生長(zhǎng)，其確切功能尚不明確。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，食物過(guò)敏癥的純母乳喂養(yǎng)嬰兒，其母乳中SST水平有顯著降低。這就聯(lián)想到了SST另一重要功能——內(nèi)源性免疫抑制因子。SST對(duì)“炎癥瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)”及“免疫過(guò)激損傷”均有顯著抑制作用[11-12]，這一作用早已用于重癥胰腺炎、多臟器損傷等的臨床治療[13-14]。因此推測(cè)，嬰兒胃腸道上豐富表達(dá)的“SST受體”不是為了感知自身血中低濃度的SST，而是為了感受母乳中的“外源性SST”，SST可能在胃腸道局部起到抑制“食物超敏免疫”，進(jìn)而誘導(dǎo)“食物免疫耐受”。結(jié)合本研究結(jié)果，添加SST后的牛乳，對(duì)胃腸道致敏性顯著降低，消化道免疫損傷有減輕。證明牛乳中添加外源性SST起到了減輕過(guò)敏免疫損傷、誘導(dǎo)食物耐受的作用。且食物中的SST主要在消化道內(nèi)形成局部高濃度，對(duì)幼崽自身血濃度影響不大。這將有利于SST作用局限于消化道，利于降低抑制生長(zhǎng)的全身性副作用。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，添加SST后，對(duì)腸動(dòng)力有抑制作用，但這一作用剛好對(duì)抗和緩解了過(guò)敏損傷導(dǎo)致的“腹瀉及腸易激蠕動(dòng)過(guò)快”。另一方面，SST+MTL組的胃動(dòng)力更接近母乳組狀況，推測(cè)可能是MTL拮抗了SST的胃動(dòng)力抑制作用。

MTL是經(jīng)典的興奮性胃腸肽代表，其類似物治療嬰兒“喂養(yǎng)困難”及“食物不耐受”療效確切[15]。MTL從外周及中樞雙重層面調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力及食欲[16]，又被稱為“增食欲肽”[17]。嬰兒期MTL處于生理性低分泌狀態(tài)[18]。我們?cè)l(fā)現(xiàn)，母乳中也有高濃度的MTL分泌，且母乳中MTL水平低下的嬰兒，更易出現(xiàn)腹脹、便秘、食欲低下等功能性消化不良癥狀。MTL水平低下也與功能性消化不良息息相關(guān)[19]。因此推測(cè)，母乳給予嬰兒必要的外源性MTL補(bǔ)充，可能起到增強(qiáng)嬰兒胃腸動(dòng)力、促進(jìn)消化酶分泌及促進(jìn)食欲作用，對(duì)于維持嬰兒快速生長(zhǎng)及支撐過(guò)重的胃腸負(fù)擔(dān)有著重要作用，這可能是“母子共生互補(bǔ)”的重要機(jī)制。而牛乳喂養(yǎng)嬰兒的食物中缺乏外源性MTL補(bǔ)充，這可能助推“喂養(yǎng)困難及食物不耐受”風(fēng)險(xiǎn)。本研究在牛乳中添加MTL后，幼鼠食欲有改善，體重增長(zhǎng)也優(yōu)于純牛乳組。SST+MTL組的胃動(dòng)力在SST抑制下，MTL顯示出對(duì)SST的拮抗平衡作用，其總體胃動(dòng)力狀況較純牛乳組有顯著改善，更為接近母乳組。證明MTL對(duì)SST的胃腸抑制作用有拮抗平衡，并對(duì)促進(jìn)食欲、促進(jìn)生長(zhǎng)及預(yù)防食物不耐受有著良好作用?？梢?jiàn)，在普通牛乳中添加MTL，有助于改善牛乳的胃腸耐受性，對(duì)預(yù)防嬰兒食物不耐受及改善喂養(yǎng)困難有積極作用。而且這一作用多數(shù)局限于消化系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)幼崽全身血循環(huán)水平影響相對(duì)較小。

SST及MTL作為兩種有拮抗相反作用的胃腸肽，為何在人母乳中同時(shí)有高濃度分泌，這也是研究中感到困惑的問(wèn)題。而本研究結(jié)果恰好可以充分揭示二者同時(shí)存在的協(xié)調(diào)機(jī)制。胃腸動(dòng)力結(jié)果顯示，SST+MTL組的胃腸動(dòng)力更傾于正常化，更接近母乳組狀態(tài)，SST與MTL顯示出相互平衡協(xié)調(diào)作用。一方面SST參與抑制食物超敏，誘導(dǎo)食物免疫耐受。另一方面，MTL拮抗SST對(duì)胃腸動(dòng)力的抑制，促進(jìn)食欲、促進(jìn)生長(zhǎng)，拮抗SST的抑制生長(zhǎng)作用。因此推測(cè)，天然母乳中的抑制性與興奮性胃腸肽之間，存在“協(xié)同/拮抗”的雙重平衡調(diào)節(jié)機(jī)制。而且母乳中的活性SST及MTL可能更多的是在消化道局部發(fā)揮作用，對(duì)幼崽自身血循環(huán)水平影響相對(duì)較小，這將有利于降低幼崽的全身性副反應(yīng)。可見(jiàn)，在普通牛乳奶粉中添加母乳劑量的SST+MTL，能改善嬰兒奶粉的消化道耐受性，降低牛乳過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)。SST+MTL組的生長(zhǎng)發(fā)育及體重增長(zhǎng)等狀況明顯優(yōu)于牛乳組，其一般狀況更接近母乳組。SST+MTL組用藥4周，顯示出良好療效，且未見(jiàn)明顯副作用及并發(fā)癥?？梢?jiàn)，在牛乳中添加“等同母乳劑量”的SST及MTL是安全的，并能顯著改善普通牛乳的胃腸耐受性及致過(guò)敏性。