丁詩(shī)瑤，雷文平，劉成國(guó)，張巖春，汪家琦，汪鎮(zhèn)南，周輝

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128;2.澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司，長(zhǎng)沙410200;3.湖南沙博安科技有限公司,長(zhǎng)沙410200）

0 引言

益生菌為具有生物活性，攝入適當(dāng)量時(shí)可以對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的微生物[1]。目前研究較多的益生菌生理功能有建立和維持腸道內(nèi)正常優(yōu)勢(shì)種群、營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇、抗腫瘤、延緩衰老等[2]。隨著生活方式的改變，益生菌的應(yīng)用擴(kuò)散到飲食保健的方方面面。目前研究較多的益生菌有雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、嗜熱鏈球菌屬等[3]，其中，植物乳桿菌在生物環(huán)境中分布廣泛，且可能具有在不同環(huán)境中有效遷移的能力[4]。從非人體環(huán)境中篩選的乳酸菌，若要采取攝入的方式對(duì)人體產(chǎn)生積極作用，需要經(jīng)過(guò)一系列的探究和鑒定，以確定乳酸菌可以相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間存在于人體且發(fā)揮其活性。FAO和WHO聯(lián)合發(fā)表《食品中益生菌評(píng)估指南》中，研究益生菌的主要試驗(yàn)包括對(duì)胃酸的耐受試驗(yàn)、黏附試驗(yàn)、對(duì)條件致病菌的拮抗活性試驗(yàn)等[5]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的不同來(lái)源的植物乳桿菌為材料，通過(guò)耐受模擬胃腸液、抑菌活性、體外安全性評(píng)價(jià)、黏附能力等方面進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)這7株植物乳桿菌的益生特性進(jìn)行初步探究，為其之后作為益生菌應(yīng)用至食品中提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）CGMCC 9181由湖南沙博安科技有限公司提供；鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）ATCC 6538由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115及不同來(lái)源植物乳桿菌由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院乳品加工實(shí)驗(yàn)室提供，其中，D04、D05、D12、D18從湖南省南山牧場(chǎng)鮮牛奶中分離，D22、D24、D26從湖南農(nóng)家自制剁辣椒中分離。

1.1.2 試劑

氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂、血平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g），北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（≥50 000 U/g），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS，以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司；抗生素試劑盒（20種），杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XW-80A漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；BKQ-B50II全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，山東博科科學(xué)儀器有限公司；HH-601超級(jí)恒溫水浴鍋，常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

將于-80℃保藏的菌株接種于新鮮無(wú)菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h活化兩代后以1%接種量接種至5 mL新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，于4℃，10 000 r/min條件下離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次后重懸，使菌懸液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為0.8～0.9。

1.3.2 耐受模擬胃腸液能力

模擬胃液配制[6]：量取1 mol/L HCl溶液20 mL，用NaOH溶液將其pH調(diào)至3，加入胃蛋白酶使其終濃度為1 g/100mL，0.22μm微孔濾膜除菌。

模擬腸液配制[7]：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使之溶解，用NaOH溶液將其pH調(diào)至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水適量溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，0.22μm微孔濾膜除菌。

將0.5 mL菌懸液加至4.5 mL模擬胃液或腸液中，混合均勻，于37℃條件下孵育3 h，分別計(jì)數(shù)0 h及3 h時(shí)混合液中乳酸菌數(shù)量，以菌株存活率評(píng)估植物乳桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受能力（以鼠李糖乳桿菌GG為陽(yáng)性對(duì)照）。菌株存活率計(jì)算公式如下：

1.3.3 膽鹽水解酶活性及蛋白水解酶活性

膽鹽水解酶活性[8]：在MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入3 g/L牛磺酸鈉，使用接種環(huán)將植物乳桿菌發(fā)酵液點(diǎn)種到培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3 d，觀察周圍是否有透明圈產(chǎn)生，以評(píng)價(jià)菌株的膽鹽水解酶活性。

蛋白水解酶活性：操作同膽鹽水解酶活性，使用1 %脫脂乳粉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 抑菌活性

使用牛津杯法測(cè)定植物乳桿菌的抑菌活性。將指示菌大腸桿菌和單增李斯特菌活化三代后，按5 ‰接種指示菌發(fā)酵液至無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，傾注至平板中待其凝固后放置牛津杯，將植物乳桿菌發(fā)酵液200μL加至牛津杯中，4℃靜置4 h后轉(zhuǎn)到37℃條件下培養(yǎng)24 h，量取抑菌圈直徑。

1.3.5 體外安全性評(píng)價(jià)

溶血性：使用血平板進(jìn)行試驗(yàn)，操作同1.3.3，以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照。

抗生素敏感性：將植物乳桿菌發(fā)酵液以5 ‰接種至無(wú)菌MRS瓊脂培養(yǎng)基中混勻后傾注平板，待凝后將20種抗生素藥敏試紙貼于平板上，37℃培養(yǎng)2 d后測(cè)定其抑制圈直徑。

1.3.6 自聚集及共聚集能力

自聚集[9]：將1 mL菌懸液用旋渦混合儀渦旋10 s，在37℃下孵育5 h，輕取200μL上層懸液，測(cè)量其600 nm處的吸光值（以鼠李糖乳桿菌GG為陽(yáng)性對(duì)照）。其自聚集公式如下：

式中：A1為處理5 h的吸光值；A0為初始菌懸液的吸光值。

共聚集：以單增李斯特菌和大腸桿菌對(duì)植物乳桿菌的共聚集能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將等體積的植物乳桿菌和致病菌菌懸液混合，渦旋振蕩10 s，在37℃下孵育5 h后，輕取200μL上層懸液，測(cè)量600 nm處的吸光值（A混）。其共聚集公式如下：

式中：A2和A3分別為受試菌與致病菌菌懸液?jiǎn)为?dú)處理5 h的吸光值。

1.3.7 疏水性

以謝璐娜[10]的方法稍作修改，將等體積的植物乳桿菌菌懸液及有機(jī)溶劑渦旋振蕩2 min，37℃靜置30 min后取水相測(cè)其吸光度。有機(jī)相選用二甲苯，正十六烷和乙酸乙酯（以鼠李糖乳桿菌GG為陽(yáng)性對(duì)照）。

1.3.8 對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

細(xì)胞培養(yǎng)：將凍存的細(xì)胞快速解凍后轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中，使用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，每2 d換液，待細(xì)胞融合度高于85 %進(jìn)行傳代，傳代5次后進(jìn)行試驗(yàn)。

黏附試驗(yàn)[11]：將細(xì)胞轉(zhuǎn)至6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層，將培養(yǎng)液吸出，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞兩次后，加入1 mL用DMEM培養(yǎng)基重懸的植物乳桿菌菌懸液（菌體濃度約為1×109mL-1），5% CO2、37℃條件下孵育2 h。用無(wú)菌PBS輕輕洗滌3次以除去未黏附的細(xì)菌，再用細(xì)胞刮板收集孔中內(nèi)容物。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板確定細(xì)胞數(shù)，附著的細(xì)菌數(shù)用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。菌株的黏附能力計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次，采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；以SPSS Statistics 26進(jìn)行方差分析（ANOVA）分析；使用Origin 2018軟件繪制結(jié)果圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐受模擬胃腸液能力

7株植物乳桿菌耐受模擬胃腸液的能力如圖1所示。人的腸胃道環(huán)境十分復(fù)雜，益生菌在胃腸道中存活的能力，將決定其能否在人體內(nèi)正常發(fā)揮益生作用[12]。本次試驗(yàn)通過(guò)人工配置胃液及腸液對(duì)7株植物乳桿菌進(jìn)行處理，37℃孵育，模擬益生菌進(jìn)入人體后在腸胃中所處的消化環(huán)境，以評(píng)估其生存能力。從圖1可以看出，7株植物乳桿菌在模擬胃腸液中的存活率均高于75 %，D05、D18在胃液中存活率可接近100 %；D22、D24、D26在腸液中存活率高于95%；其中，D24在胃腸液中存活表現(xiàn)最為突出，與陽(yáng)性對(duì)照LGG相當(dāng)。進(jìn)入人體的乳酸菌克服了胃腸中的惡劣環(huán)境，才能夠進(jìn)一步在腸道中定植，以發(fā)揮其效用。

圖1 植物乳桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受性

2.2 抑菌活性

本次試驗(yàn)選用革蘭氏陽(yáng)性菌單增李斯特菌和陰性菌大腸桿菌來(lái)測(cè)定這7株植物乳桿菌的抑菌活性，由圖2可知，這7株菌對(duì)兩種致病菌均有一定的抑制能力，其中，D04和D24的抑制能力較為優(yōu)秀，D04對(duì)大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制圈均高于17.5 mm，D24對(duì)單增李斯特菌的抑制圈達(dá)到22 mm。益生菌的抑菌能力，能一定程度上幫助宿主在其腸胃道中抵御有害致病菌的侵襲，且應(yīng)用于食品中時(shí)，能夠抑制食品中腐敗菌的生長(zhǎng)，則有助于延長(zhǎng)商品貨架期[13]。

圖2 7株植物乳桿菌的抑菌活性

2.3 膽鹽水解酶活性及蛋白水解酶活性

益生菌具有膽鹽水解酶活性有助于增強(qiáng)菌株對(duì)膽鹽的耐受性，延長(zhǎng)菌體在腸胃道的滯留時(shí)間，改變宿主的消化功能或降低血清中膽固醇水平[14-15]。而具有蛋白水解酶活性的益生菌能分解外界蛋白質(zhì)加以利用，也可以分泌蛋白酶幫助宿主消化[16]。由結(jié)果得知，7株菌都具備一定的膽鹽水解酶活性和蛋白水解酶活性，D04、D12的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象更為明顯，水解能力更佳，可進(jìn)一步確定其酶活，作為潛在降膽固醇益生菌株繼續(xù)探究。

表1 7株植物乳桿菌的膽鹽水解酶活性及蛋白水解酶活性

2.4 體外安全性評(píng)價(jià)

乳酸菌可能會(huì)存在某些潛在的安全性問(wèn)題，《食品中益生菌評(píng)估指南》中建議，測(cè)定益生菌菌株安全性需確定菌株耐藥性和溶血性[5]。使用血平板測(cè)定這7株植物乳桿菌的溶血性結(jié)果顯示，7株菌均未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象；使用抗生素藥敏片對(duì)其耐藥性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)D04對(duì)20種抗生素均有一定的敏感性，但其他6株植物乳桿菌對(duì)不同的抗生素具有一定的耐藥性，如苯唑西林，D12、D24和D26對(duì)其不敏感，氨基糖苷類如卡那霉素、新霉素、慶大霉素，D05和D22對(duì)其均不敏感。這些結(jié)果與之前報(bào)道的一些乳酸桿菌耐藥研究相一致[17-18]。

表2 7株植物乳桿菌的溶血性

2.5 自聚集及共聚集能力

由圖3所示，7株植物乳桿菌的聚集能力差異較大。其中D05和D22的自聚集與共聚集能力都強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照LGG；D12的自聚集能力最強(qiáng)，但與病原菌共聚集的能力不突出，特別是與單增李斯特菌的共聚集能力只有10 %；除D18，其他植物乳桿菌的自聚集能力均高于致病菌，這與一些文獻(xiàn)報(bào)道益生菌的自聚性高于致病菌的結(jié)果相一致[19-20]。在與病原菌單增李斯特菌和大腸桿菌的共聚集能力結(jié)果中，D22的效果最為明顯，均超過(guò)90%。有研究表明，乳酸菌的自聚集能力與其在體內(nèi)的黏附能力相關(guān)[21]，而乳酸菌與致病菌間的共聚集能力可能與之和致病菌競(jìng)爭(zhēng)黏附腸上皮細(xì)胞有密切關(guān)系[22]。

表3 7株植物乳桿菌的抗生素敏感性

圖3 7株植物乳桿菌的聚集能力

2.6 疏水性

圖4 所示7株植物乳桿菌及LGG的疏水性結(jié)果。除D05和D12外，其他5株菌的疏水率均高于LGG，尤其D04對(duì)3種有機(jī)試劑的疏水率均超過(guò)70 %，且對(duì)乙酸乙酯表現(xiàn)出7株菌中最佳的疏水性；D24對(duì)二甲苯和十六烷的疏水率均高于82 %，在二甲苯中表現(xiàn)為最佳，十六烷中略低于D18的84 %；D05和D12疏水性都很低，但其自聚集能力都較高。一些研究人員對(duì)乳酸菌與小鼠腸黏液的黏附能力及對(duì)應(yīng)的菌株的表面疏水性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)菌株的黏附能力與疏水性之間不存在明顯相關(guān)性，故而菌株表面疏水性的高低并不能完全代表菌株黏附能力的強(qiáng)弱[23-24]。

圖4 7株植物乳桿菌的疏水性

2.7 對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

益生菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附，是發(fā)揮其益生作用的先決條件，但直接在體內(nèi)研究黏附能力難度較大，故而選用類似于人小腸上皮細(xì)胞的Caco-2細(xì)胞來(lái)評(píng)估益生菌的黏附能力。7株植物乳桿菌的黏附能力如圖5所示，7株菌的黏附能力差異較大，D12的黏附能力最為突出，平均每個(gè)Caco-2細(xì)胞能黏附超過(guò)58個(gè)乳酸菌，D05、D22、D24、D26高于20 CFU/cell，黏附能力較好。病原菌黏附于腸道黏膜被認(rèn)為是其致病的第一步[25-26]，益生菌在宿主腸道中定植后，將在腸黏膜層形成生物膜或占據(jù)黏附位點(diǎn)，阻止病原菌對(duì)宿主腸黏膜受體的結(jié)合，甚至清除病原菌[11]。

圖5 7株植物乳桿菌的黏附能力

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)7株不同來(lái)源植物乳桿菌的益生特性進(jìn)行探究，確定其在模擬胃腸液中耐受存活率均高于75%；均具有膽鹽水解酶及蛋白水解酶活性；對(duì)大腸桿菌和單增李斯特菌具有一定抑制能力；無(wú)溶血性且對(duì)大部分抗生素敏感；其中，D12具有最強(qiáng)的自聚集能力及最佳黏附能力；而D05和D22的聚集能力表現(xiàn)較佳，D04和D18的疏水能力更強(qiáng)。因此，這7株植物乳桿菌可作為潛在益生菌菌株應(yīng)用于食品中，但7株菌的益生特性各有側(cè)重，需要進(jìn)一步對(duì)其優(yōu)勢(shì)方面進(jìn)行探究，運(yùn)用于不同食品中以發(fā)揮其最大效用。