黃銳，孫娜娜，張涵，楊孟迪，劉金虎，徐秦峰

(1.中墾華山牧乳業(yè)有限公司，陜西渭南714000；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院國家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，西安710021)

0 引言

乳鐵蛋白（Lactoferrin，簡稱Lf）是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中一種分子量為78 ku的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，含有約690個(gè)氨基酸殘基。乳鐵蛋白是乳中至關(guān)重要的鐵結(jié)合蛋白，主要存在于多種哺乳動物組織及外分泌液中，具有抵抗真菌和病菌感染、促進(jìn)鐵吸收、促成骨作用等多種生物活性功能[1-4]。并可通過調(diào)節(jié)活化先天免疫和適應(yīng)性免疫的相關(guān)免疫細(xì)胞，使得促炎和抗炎細(xì)胞因子達(dá)到動態(tài)平衡，從而有效增強(qiáng)機(jī)體尤其是腸道的免疫功能[5]。

近年來，無論是城鎮(zhèn)還是農(nóng)村，隨著人民生活水平提高，對于牛奶的品質(zhì)要求也越來越高，“能喝到牛奶”的消費(fèi)需求已是過去式，現(xiàn)如今“喝到好牛奶”才是消費(fèi)者的真正訴求[6]。傳統(tǒng)的常溫奶采用超高溫瞬時(shí)殺菌工藝，雖會顯著延長牛奶的保質(zhì)期，達(dá)到遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)哪康模邷責(zé)崽幚頃T導(dǎo)乳蛋白的變性和聚集、乳糖異構(gòu)化、造成維生素及營養(yǎng)物質(zhì)的流失。近兩年，由于巴氏鮮奶符合人們對于新鮮、營養(yǎng)、質(zhì)優(yōu)的追求而逐漸進(jìn)入我國消費(fèi)者視線，采用巴氏殺菌工藝，可在較低溫度下殺死致病微生物，雖無法達(dá)到完全除菌效果，需要全程冷鏈運(yùn)輸，保質(zhì)期僅有5～8 d，但卻最大程度保留了牛奶中風(fēng)味、營養(yǎng)及活性物質(zhì)。所以巴氏奶才稱得上是“鮮牛奶”而UHT常溫奶只能稱作“純牛奶”[7]。

Sanchez[8]發(fā)現(xiàn)UHT（135℃處理4 s）超高溫處理會嚴(yán)重破壞乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)，使其無法結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁上脂多糖，失去抗菌活性，而巴氏殺菌（72℃處理15 s）后holo-Lf和apo-Lf抗菌活性則未受到影響。研究表明[9-10]，由于乳鐵蛋白鐵結(jié)合能力易受到其熱敏性影響，熱變性程度隨溫度升高而逐漸增加，最終會對免疫活性等生理功能產(chǎn)生不可逆的影響。在保證優(yōu)質(zhì)奶源的前提下，最大程度保留牛乳中熱敏蛋白活性的工藝顯得尤為重要。因此，乳鐵蛋白含量的測定對牛乳生產(chǎn)過程中熱加工的風(fēng)險(xiǎn)評估和營養(yǎng)價(jià)值評定都具有重要的參考意義，確定最佳巴氏殺菌參數(shù)，是推進(jìn)巴氏奶的必由之路，也將為中國優(yōu)質(zhì)乳工程的新未來指引方向。

目前常用的乳鐵蛋白檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、SDS-PAGE、超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。由于乳制品中成分的復(fù)雜性及乳鐵蛋白含量占比較低，大多數(shù)高效液相色譜法[11-15]均需通過調(diào)節(jié)pH沉淀去除酪蛋白及肝素親和柱的特異性吸附富集進(jìn)行檢測，成本較高。毛細(xì)管電泳法[16]雖然靈敏度和分辨率高，所需進(jìn)樣量少，但毛細(xì)管內(nèi)壁需要進(jìn)行涂層以抑制蛋白質(zhì)吸附，重現(xiàn)性較差。表面等離子共振技術(shù)[17]無需進(jìn)行放射性標(biāo)記便可實(shí)時(shí)、自動檢測嬰兒配方奶粉中低含量的乳鐵蛋白，但實(shí)驗(yàn)技術(shù)中溫度及樣品組成都會對結(jié)果產(chǎn)生影響，且儀器設(shè)備昂貴。超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)新穎、靈敏度高，但必須通過胰蛋白酶水解消化尋找特征片段作為信號分子[18]。李珊珊等通過SDS-PAGE法[19]實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白的定量檢測，準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好但凝膠染色脫色時(shí)間較長，其他蛋白會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的干擾。酶聯(lián)免疫夾心抗體法[20-22]靈敏度高但抗體制備復(fù)雜，試劑盒昂貴，進(jìn)行測定時(shí)需要多次稀釋才能保證讀取有效的吸光度值，耗時(shí)較長。因此，如何確定乳鐵蛋白含量的高效、準(zhǔn)確、簡便的測定方法仍是目前亟需解決的問題之一。

本文建立了一種基于凝膠電泳遷移率（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）原理的乳鐵蛋白檢測的方法，操作簡單、檢測成本低，對企業(yè)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)乳制品中乳鐵蛋白的定量檢測具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Loading buffer（6×）以及DL500 bp DNA marker(Takara）,FAM-DNA序列(上海生工生物工程公司)，各蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、100×TE緩沖液以及磷酸鹽緩沖液PBS（Sigama-Aldrich），Sybr Gold染料(Invitrogen)，丙烯酰胺，過硫酸銨，TBE緩沖液。

5424R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf有限公司；垂直電泳儀，Bio-rad；DK-8D電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MYSPIN12微型離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-rad,Chemi-DocTMMP。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

液態(tài)奶樣品購買于當(dāng)?shù)爻?，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，冰箱4℃儲存待用。奶粉樣品購買于當(dāng)?shù)爻校貎Υ娲谩?/p>

1.3 溶液配制

(1)DNA序列儲備液：DNA引物3 000～4 000 r/min冷凍離心1min防止粉末飛散，按照管上提示在超凈工作臺中加入一定體積的1×TE緩沖液，渦旋振蕩5 min充分溶解后3 000～4 000 r/min冷凍離心1 min落至管底，此時(shí)濃度為100μmol/L作為儲備液置于冰箱4℃保存。

(2)PBS緩沖液(1×)：取一袋內(nèi)容物溶于1 L蒸餾水或去離子水。25℃時(shí)pH為7.4，包含NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,Na2HPO4·12H2O 10 mmol/L,KH2PO42 mmol/L。

(3)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品儲備液(1 mg/mL)：稱取各蛋白(乳鐵蛋白Lf，酪蛋白Casein、乳球蛋白β-Lg、乳白蛋白α-Lac)標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，1×PBS溶液溶解并定容至1 mL，各蛋白標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液濃度為1 mg/mL。

(4)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品使用液(100μg/mL)：將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液用1×PBS緩沖液稀釋10倍，各蛋白溶液濃度為100μg/mL。

1.4 測定方法

1.4.1 DNA序列前處理

為了使DNA序列的構(gòu)象更好的結(jié)合乳鐵蛋白，進(jìn)行退火處理。DNA序列儲備液用1×的PBS稀釋至1μmol/L，95±0.5℃加熱5～10 min，冰箱-20℃下2 min冷卻待用。

1.4.2 樣品制備

5μL退火后的DNA序列加入Lf標(biāo)準(zhǔn)使用液或含乳鐵蛋白的待測樣品，加入1×的PBS至終體積為20μL，在37±0.5℃下孵育20 min。

液態(tài)乳樣品混勻，生牛乳加樣量0.5μL、巴氏乳加樣量1μL、常溫乳加樣量3μL；奶粉樣品稱取1 g奶粉超純水溶解至7 mL，加樣量6μL。

1.4.3 電泳

(1)電泳：樣品中混入6×Loading buffer（含溴酚藍(lán)溶液）3μL。電泳參數(shù)：電壓100 V，時(shí)間35 min，電泳緩沖液為1×TBE，膠濃度10%。為防止熒光降解，電泳過程應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。

(2)10%PAGE配方：超純水5.445 mL，5×TBE緩沖液2 mL，40%聚丙烯酰胺2.5 mL，10%過硫酸銨50μL，

TEMED 5μL。

1.4.4 凝膠成像以及數(shù)據(jù)采集

凝膠成像系統(tǒng)配套的分析軟件Image lab進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇ALEXA488通道，獲取電泳結(jié)果。點(diǎn)擊“quantity Tools”讀取各條帶的熒光強(qiáng)度值。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)

前處理后的DNA序列5μL，分別加入乳鐵蛋白以及酪蛋白、乳球蛋白、乳白蛋白使用液2.5μL，加1×PBS至終體積為20μL，混勻孵育。結(jié)果通過凝膠電泳結(jié)果以及采集復(fù)合物條帶灰度值驗(yàn)證。

1.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

取5μL前處理后的DNA序列(1μmol/L)，分別加入乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品使用液0、1、2、3、4、5μL，加入1×PBS至終體系為20μL。離心，37±0.5℃孵育20 min。按照上述建立的方法采集復(fù)合物條帶熒光灰度值，根據(jù)乳鐵蛋白質(zhì)量和復(fù)合物條帶灰度值繪制乳鐵蛋白檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 可行性驗(yàn)證

EMSA是研究DNA分子和蛋白質(zhì)相互作用的常用方法[23-25]。由于DNA-protein復(fù)合物和游離DNA的電泳遷移率差異，通過結(jié)合后在PAGE電泳圖譜中觀察到滯后條帶，來判斷特異性結(jié)合作用的發(fā)生[26]。乳鐵蛋白等電點(diǎn)pI較高為8～9.5，其表面含有多個(gè)帶正電荷的堿性區(qū)域，可以結(jié)合DNA、肝素等大分子物質(zhì)[27]，部分研究篩選出和乳鐵蛋白發(fā)生特異性結(jié)合的DNA序列片段[28-31]，本研究通過先前實(shí)驗(yàn)對比選取DNA序列[32](5’-(FAM)AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3’)作 為 探 針 分 子 結(jié)合Lf，由 于 該DNA序列能夠特異性結(jié)合Lf而無法結(jié)合其他蛋白，從而實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白和其他蛋白的有效分離，避免傳統(tǒng)儀器檢測復(fù)雜的前處理過程。

將乳鐵蛋白和牛乳中的其他蛋白，如酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白以及結(jié)合緩沖液分別和FAM熒光標(biāo)記的DNA序列孵育，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，驗(yàn)證方法的可行性。結(jié)果如圖1所示，各泳道均可觀察到游離的DNA序列條帶，只有加入乳鐵蛋白的泳道觀察到了滯后的復(fù)合物條帶。表明只有乳鐵蛋白和DNA序列發(fā)生了特異性結(jié)合使得分子量增大，遷移速率較慢，同時(shí)游離的DNA泳帶熒光亮度減弱。因此，可以通過DNA-Lf復(fù)合物條帶熒光增強(qiáng)或者游離的DNA熒光減弱，實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白的特異性定性檢測。

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建立的PAGE法可以用于乳鐵蛋白的定量檢測，將不同濃度乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別和DNA序列孵育，結(jié)合緩沖液做空白對照，采集各復(fù)合物灰度值。結(jié)果如圖2所示：隨乳鐵蛋白含量的增加，復(fù)合物條帶的亮度不斷增大，游離的DNA序列的亮度明顯降低直至逐漸消失。采集各泳道復(fù)合物灰度值，以乳鐵蛋白的質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)，Lf-DNA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=-1606.47619+93.10857x，R2=0.9936。結(jié)果表明該方法用于乳鐵蛋白的定量檢測呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 實(shí)際樣品檢測

圖1 PAGE電泳檢測乳鐵蛋白的特異性

圖2 不同濃度乳鐵蛋白的電泳圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

為驗(yàn)證PAGE法可用于檢測實(shí)際樣品中乳鐵蛋白含量，采用上述方法對市售的6種乳制品（生牛乳、巴氏殺菌乳、常溫乳、陰性奶粉樣品、兩種陽性奶粉樣品）簡單稀釋后，直接進(jìn)行乳鐵蛋白定量檢測。并通過兩種陽性奶粉樣品的檢測值和標(biāo)示值進(jìn)行對比，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。添加乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定回收率；對每種樣品重復(fù)3次測定精密度。結(jié)果如表1所示。樣品的加標(biāo)回收率在70%～109%之間，生牛乳的乳鐵蛋白檢測量高于巴氏乳、常溫乳，與預(yù)期相符。不同熱加工工藝導(dǎo)致乳鐵蛋白的熱損失不同，證明本方法對于液態(tài)乳的熱加工風(fēng)險(xiǎn)評估具有一定的參考意義。陽性奶粉檢測值分別為29.42±0.025 mg/100 g(標(biāo)示值為30 mg/100 g)以及46.18±0.01 mg/100 g(標(biāo)示值為45mg/100 g)，與標(biāo)示值接近，表明本研究僅需簡單稀釋、無需繁瑣前處理就可實(shí)現(xiàn)乳制品中乳鐵蛋白的定量檢測。因此，本方法可為企業(yè)優(yōu)質(zhì)乳的生產(chǎn)過程監(jiān)管以及奶粉的營養(yǎng)價(jià)值評估提供一定的技術(shù)支持。

表1 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

圖3 實(shí)際樣品檢測電泳圖

3 結(jié)論

嬰幼兒奶粉中添加乳鐵蛋白使其母乳化，增強(qiáng)嬰兒免疫力，但乳鐵蛋白的過量添加會對嬰兒的肝腎功能造成負(fù)擔(dān)；液態(tài)乳熱處理工藝的不同，天然功能性乳鐵蛋白的保留程度不同[33]。因此，乳鐵蛋白含量的測定對牛乳生產(chǎn)過程中過熱加工的風(fēng)險(xiǎn)評估和嬰幼兒配方奶粉的營養(yǎng)價(jià)值評定都具有重要的參考意義。由于乳制品樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，乳鐵蛋白豐度較低目前國內(nèi)外仍然沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。本研究通過DNA序列和乳鐵蛋白的特異性結(jié)合，避免了傳統(tǒng)儀器檢測乳鐵蛋白繁瑣的前處理過程?；谟坞xDNA序列和Lf-DNA復(fù)合物的凝膠電泳遷移率差異通過復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值和乳鐵蛋白濃度呈現(xiàn)的良好線性關(guān)系建立了一種低成本、易操作、高效的生牛乳等乳制品中乳鐵蛋白的PAGE電泳定性、定量檢測方法。對液態(tài)乳的熱加工工藝的控制以及奶粉的營養(yǎng)價(jià)值評估均具有重要意義。