趙楊靜 唐 楠 唐道城 張 靜

（青海大學高原花卉研究中心，青海省園林植物與觀賞園藝重點實驗室，西寧 810016）

植物內源激素是指在植物體內合成的、通常從合成部位運往作用部位對植物的生長發(fā)育起顯著調節(jié)作用的微量生理活性物質［1～3］，主要包括生長素類、赤霉素類、細胞分裂素類、脫落酸和乙烯［4］。植物生長發(fā)育過程中，任何一種生理效應都是各類激素相互作用的結果，其中激素在植物的成花及其他生長發(fā)育中都起著關鍵性作用［5］。

郁金香（Tulipa gesneriana L.）為百合科（Lilia?ceae）郁金香屬（Tulipa L.）多年生鱗莖類草本花卉，是世界上著名的觀賞植物之一，廣泛應用于切花、盆栽和庭院種植［6］。郁金香是典型的夏休眠球根花卉，需要經過一段時間的低溫處理才能打破休眠，促進花莖發(fā)育和伸長［7～8］。王曉東等對郁金香生長發(fā)育和內源激素含量進行了研究，實驗結果皆表明內源激素對郁金香的花芽分化，生長發(fā)育起著重要的調節(jié)作用［9］。這種對環(huán)境的反應及花莖發(fā)育與伸長基因的表達均受自身內源激素的調控，所以鱗莖體內內源激素的分布規(guī)律和含量的準確測定，對研究植物生理變化及栽培應用都具有重要意義［10］。

目前，測定植物內源激素的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［11］、液相色譜串聯(lián)質譜法（HPLC-MS）［12］、氣相色譜串聯(lián)質譜（GC-MS）及免疫分析法（ELISA）等［13］。田如男、魏鈺等用ELISA法對郁金香球內的內源激素進行了研究，試驗得出該方法具有操作簡單、快速、敏感性高的特點，但重現(xiàn)性差、易交叉感染、不能同時分析多種激素，在精確定量測定方面存在不足［2，14～15］。GC-MS法廣泛應用于有機物的現(xiàn)場分析檢測，定量分析精度高，定性能力高，但維護成本高，結構復雜，在實驗室使用時要經過專門培訓的技術職員才能操縱質譜儀［16］。HPLC-MS 法可以直接分析激素，具有分析速度快，定性分析結果可靠，但儀器的高成本阻礙了其更廣泛的應用［14］。HPLC 法是除了乙烯以外，其他內源激素均可測定的方法［17］。侯凱、李華、范光宇等均用HPLC 法測定川白芷、枇杷果實和谷子葉尖組織中的內源激素的含量［18～20］，結果表明，該方法廣泛應用于植物內源激素的測定，具有簡單快捷，費用低、重現(xiàn)性較好等優(yōu)點。

HPLC 法也應用于百合科植物內源激素的檢測［21］，但在測定郁金香鱗莖內源激素含量和程序優(yōu)化這一方面研究報導較少。本研究以郁金香鱗莖為材料，通過對高效液相色譜條件和提純方法的選擇，篩選出能高效測定郁金香鱗莖內GA3、IAA 和ABA 3 種內源激素的方法。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，能夠滿足郁金香鱗莖主要內源激素的定量分析，為郁金香鱗莖激素變化規(guī)律的研究供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀（Agilent 1260，配UV 檢測器）、C18 固相色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm Agi?lent ZORBAX SB-C18）、氮吹儀（上海海科DCY-12G）、冷凍離心機（SIGMA 3-30K）、冰箱（AUCMA BCD-239EG）、搖床培養(yǎng)箱（新苗全溫培養(yǎng)搖床QYC-200）、超純水制備系統(tǒng)（優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)）、超低溫冰箱（Thermo scientific）、Eppendorf 移液器、萬分之一天平（上海良平FA1004）。

赤霉素（GA3，純度≥98.6%）、吲哚-3-乙酸（IAA，純度≥99.3%）、脫落酸（ABA，純度≥98.5%）標準品購自Sigma Aldrich，異丙醇（分析純）、鹽酸、二氯甲烷（分析純）、磷酸（分析純）、甲醇（色譜純）。

試驗以青海大學高原花卉研究中心自繁的郁金香品種“Golden Apeldoorn”為材料，選取周徑8～10cm，基盤無損傷且無病蟲害的鱗莖。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18；流動相：A（甲醇）∶B（磷酸緩沖液pH=3.5）=45∶55；流速1 mL·min-1；檢測 波長：0～3.2 min 265 nm，3.0～4.5 min 212 nm，4.5～6.5 min 218 nm，6.5～13.0 min 265 nm；自動進樣，進樣量10 μL；柱溫20℃。

1.2.2標樣制備

分別標準稱取1 000 μg GA3、IAA、ABA 標準品溶于80%甲醇中配制成1 000 μg·mL-1的溶液，最后稀釋成7 個濃度梯度，過0.45 μm 有機針孔濾膜，置于-80℃超低溫冰箱備用（見表1）。

1.2.3樣品前處理

取郁金香鱗莖，置于冰塊上迅速切碎混合，放入研缽，液氮中研磨成粉末。

異丙醇提取方法：稱后取0.5 g鱗莖粉末，加入5 mL 提取液A（超純水∶異丙醇∶鹽酸=1∶2∶0.002，V/V/V），4℃搖床100 r·min-1處理30 min，加入8 mL提取液B（二氯甲烷），4℃搖床100 r·min-1處理30 min；取出后4℃5 000 r·min-1離心15 min，此時溶液分層，粉末狀組織呈絮狀，位于兩層溶液之間；用巴氏滴管吸取下層溶液，氮氣吹干，加入1.0 mL 流動相溶解；過0.45 μm 有機針孔濾膜，裝入樣品瓶中置于4℃冰箱待測。

表1 混合標準品的7個濃度梯度Table 1 Seven concentration gradients of mixed standards

80%甲醇提取方法：稱取鱗莖粉末1.0 g，加入10 mL 預冷80%甲醇，4℃冰箱過夜；4℃5 000 r·min-1離心15 min，取上清液，殘渣用5 mL 80%甲醇清洗，離心合并上清液；氮氣蒸發(fā)至原體積的1/3，調pH 至8.0，加入0.2 g PVPP，充分搖勻，冰箱放置30 min，離心，取上清液調pH至3.0，乙酸乙酯等體積混合萃取3次，合并3次萃取液，氮氣吹干，1 mL 流動相溶解，過0.45 μm 有機針孔濾膜，裝入樣品瓶中置于4℃冰箱待測。

2 結果與分析

2.1 流動相初選

設置7 個流動相選擇，其他條件均一致（流速為1.0 mL·min-1，進樣10 μL，檢測波長254 nm，柱溫20℃），進行流動相的選擇（見表2）。七個流動相對混合標準品GA310 000 ng·mL-1，IAA 2 000 ng·mL-1，ABA 10 000 ng·mL-1進行檢測，積分標準為斜率靈敏度0.05，峰寬0.02，最小峰面積0.05，分離度大于1.5為完全分開（見表3）。

測定過程中按各激素的保留時間為順序，分別 為GA3、IAA 和ABA。流 動 相1 測 定 時 間 為30.041 min，測定時間過長；流動相3、4、7的測定時間分別為4.534、4.326和4.733min，測定時間過短，若樣品中雜質未去除干凈，可能會與GA3峰重疊，從而導致分離效果差；流動相2、5、6檢測時間分別為10.349、17.377、8.824 min，檢測時間較適合，分離度和對稱因子較高，其中流動相5峰寬較寬，專一性會降低，因此初步選取的流動相為2、6（見圖1）。

表2 7個流動相的配比Table 2 Ratio of seven mobile phases

2.2 波長選擇及流動相改進

由流動相初選可知，254 nm波長下GA3和IAA峰面積小，不利于更低量的測定，所以需對測定波長進行選擇。GA3的最大紫外吸收波長為210 nm［29］，ABA 最大吸收波長為265 nm［30］，通過對標準品IAA 的不同波長測定（見表4），可得IAA 的最大吸收波長為218 nm。

由于甲醇的截止波長為210 nm，在210 和218 nm 噪聲較大色譜基線不穩(wěn)定，而在265 nm 處基線噪音更小，所以除測定激素時間外，其他時間選用265 nm，即切換波長時間設定為0～3 min 265 nm，3.0～3.5 min 212 nm，3.5～5.2 min 218 nm，5.2～12.0 min 265 nm。切換波長測定中，因為冰乙酸的截止吸收波長為230 nm，流動相2 在低波長210 nm 和218 nm 處基線不穩(wěn)定，所以用磷酸（截止波長210 nm）代替冰乙酸，調pH=3.5，分別用改良流動相2 和流動相6 切換波長對標準品進行檢測，二者均可得到良好的色譜信號，由于乙腈價格較甲醇高，本試驗選擇改良流動相2，以甲醇和磷酸緩沖液（pH=3.5）以45：55（V/V）作為流動相。

表3 7個流動相色譜參數(shù)Table 3 The chromatographic parameters of seven mobile phases

表4 HPLC法不同波長IAA色譜峰參數(shù)Table 4 Chromatographic parameters of IAA in differ‐ent wavelengths

2.3 柱溫和流速的選擇

柱溫設定為20℃、25℃、30℃、35℃，結果表明，柱溫對色譜分離影響不大，主要是影響保留時間和壓力，柱溫越高，保留時間越短，柱內壓力越小，但考慮GA3分離時間不能提前，且高溫不利于激素保存，所以本試驗選擇20℃為檢測柱溫。

流速設定0.8、1.0、1.2 mL·min-1，結果表明流速對各激素峰形影響不大，流速越大，分離時間越短，柱壓越大，綜合時間和柱壓考慮，流速選用1.0 mL·min-1。

2.4 內源激素測定方法分析

2.4.1定性分析

利用以上優(yōu)化條件，對標準品混合樣GA310 000 ng·mL-1，IAA 2 000 ng·mL-1，ABA 10 000 ng·mL-1進行測定，3 種植物激素保留時間依次為3.688 0±0.002 min、5.794±0.002 min、11.324±0.004 min（見圖2）。

2.4.2定量分析

將配制的7 個濃度梯度混合標準品進行HPLC 檢測。以峰面積為縱坐標（y），含量為橫坐標（x），得到各內源激素的線性回歸方程及相關系數(shù)（見表5）。

表5 3種內源激素標準品的標準曲線Table 5 The standard curve of three endogenous hor‐mone standards

2.5 樣品處理方法的選擇

本試驗用異丙醇［4］和80%甲醇［2，15，31］作為提取試劑。兩種方法均能提取檢測出3 種激素（見圖3），經定量檢測80%甲醇提取方法測定激素含量分 別 為：GA3（103.549±3.690）ng·g-1FW，IAA（11.378±2.050）ng·g-1FW，ABA（136.451±4.880）ng·g-1FW；異丙醇提取劑提取方法測定激素含量分 別 為：GA3（1 140.232±23.686）ng·g-1FW，IAA（20.145±2.979）ng·g-1FW，ABA（117.733±19.395）ng·g-1FW。定量對比可得，80%甲醇作為提取劑進行樣品提取GA3損失較多，綜上所述，選擇異丙醇提取方法作為郁金香鱗莖激素提取方法。

2.6 回收率測定

標準品母液精確取10 000 ng GA3，2 000 ng IAA，10 000 ng ABA 加入5 mL 異丙醇提取液試管中，按照樣品處理方法處理標準品，HPLC 進行6次平行檢測，計算回收率。3種激素回收率分別為：GA389.190%，IAA 84.821%，ABA 95.679%，相對標準偏差依次為：6.432%，4.373%，2.831%（見表6）。

表6 3種內源激素的回收率及相對標準偏差Table 6 Recoveries and RSDs of three endogenous hor‐mones

3 討論

植物內源激素的提取是定量檢測的第一步也是關鍵步驟，樣品的處理方法主要有液氮研磨［20］、冰浴研磨［32］、常溫研磨［33］3 種，本試驗結合實驗室條件，為了最大程度保持激素活性，最終采用液氮研磨樣品的方法。目前，植物激素的提取方法多采用溶劑提取法，常用溶劑有甲醇、丙酮、丙醇水溶液及其他中性酸性緩沖溶液［34～35］，因甲醇分子量小，植物激素提取中多采用甲醇作為提取劑［22～24］，但甲醇滲透性極強，選擇性低，易將植物細胞內的多酚類物質和植物內源激素一并提取出來，故在測定植物內源激素前需要通過一定的純化步驟，盡可能地將這些雜質除去，這就導致后續(xù)工序復雜，工作量加大，提取率降低。郁金香鱗莖的多酚類物質含量較高［36］，為簡化后續(xù)試驗步驟，保證較高的提取效果，因此本研究選擇異丙醇溶液作為郁金香鱗莖內源激素提取劑。

國內有大量HPLC 法測定植物激素的方法報道，但因儀器、分離柱及溫度、氣壓等因素的差異，各實驗室分離條件參數(shù)相差較大。本方法參考國內常見植物內源激素的樣品前處理方法和色譜測定參數(shù)，從樣品研磨方法、樣品激素提取劑的選擇，流動相、流速、柱溫、吸收波長等方面進行了優(yōu)化，最終篩選出一套適合實驗室高效液相色譜儀同時測定郁金香鱗莖中3種植物內源激素的方法。該方法以液氮研磨樣品，異丙醇為激素提取劑，Agilent1260 高效液相色譜儀為檢測儀器，色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18；流動相A（甲醇）∶B（磷酸緩沖液pH=3.5）=45∶55；流速1.0 mL·min-1；檢測波長0～3.2 min 265 nm，3.0～4.5 min 212 nm，4.5～6.5 min 218 nm，6.5～13.0 min 265 nm；自動進樣，進樣量10.0 μL；柱溫20℃，且均在各激素最大吸收波長進行定量測定，基線平穩(wěn)，準確度高，可得到滿意的峰形，色譜圖規(guī)范整齊，試驗前處理簡單，可操作性強，回收率和精密度較高，可滿足測定郁金香鱗莖GA3、IAA、ABA含量的要求。