任夢軒 張 洋 王 爽 王瑞琪 劉 聰 魏志剛

（1. 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 國家林業(yè)與草原局鹽堿地研究中心，中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091）

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育以及應(yīng)對環(huán)境變化中發(fā)揮極為重要的作用［1］。研究表明，植物基因組有6%～10%基因編碼產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子，主要包括AP2/ERF、ARF、bZIP/HD-ZIP、C2H2、GRAS、MYB/MYC、WRKY、bHLH、NAC 和GATA 等家族［2］。如擬南芥（Arabidopsis thaliana）具有34 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，共有1 533 基因，其中約45%的轉(zhuǎn)錄因子屬于植物特有的［3］。

1988 年，Evans 等［4］首次報(bào)道（T/A）GATA（A/G）序列是在雞的珠蛋白基因啟動(dòng)子上，1991 年發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子GATA-1。隨后，又鑒定出GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5 和GATA-6 等基因，由此形成了GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族［5］。隨后，在植物中也鑒定出一批能結(jié)合WGATAR 序列（W 為T 或A；R為G或A）的轉(zhuǎn)錄因子，且大多含有1個(gè)CX2CX18CX2C結(jié)構(gòu)域，有些成員則含有一個(gè)CX2CX20CX2C結(jié)構(gòu)域或編碼一個(gè)2 鋅指結(jié)構(gòu)域［6～7］。目前為止，已先后對擬 南芥［7］、蓖麻（Ricinus communis L.）［8］、蘋 果（Malus domestica）［9］、水稻（Oryza sativa L.）［10］、番茄（Solanum lycopersicum）［11］和辣椒（Capsicum annu?um L.）［12］等植物的GATA 家族成員進(jìn)行了全基因水平的鑒定。如擬南芥GATA 基因家族包含30 個(gè)基因，可分成4 個(gè)亞族，并且在光響應(yīng)調(diào)控和葉綠素合成［13～16］、細(xì)胞分裂素響應(yīng)［17～18］、花發(fā)育［19］和種子萌發(fā)［20］等多個(gè)生物學(xué)過程扮演著重要角色。

毛果楊（Populus trichocarp）是第一個(gè)全基因測序并注釋的木本植物，并且具有相對較小的基因組（422.9 Mb）、廣泛的適應(yīng)性、容易的轉(zhuǎn)基因操作和較高生長速率等特點(diǎn)，因此其已成為研究木本植物復(fù)雜性狀形成分子機(jī)制、基因功能解析、比較基因組學(xué)等分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)研究中的模式物種［21］。研究表明，毛果楊基因組含有58 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，共有4 287 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因［22］。然而，目前為止，尚無有關(guān)毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族基因基本特性的分析報(bào)導(dǎo)。為此，本項(xiàng)研究從基因組水平對毛果楊GATA 基因家族的基因與編碼蛋白的基本特性，以及各基因的組織與鹽脅迫響應(yīng)表達(dá)特性進(jìn)行初步研究。上述工作將對毛果楊GATA 家族各基因在其生長發(fā)育與鹽脅迫響應(yīng)中的生物學(xué)功能解析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

毛果楊材料來源于林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（東北林業(yè)大學(xué)）溫室（長日照16/8 h、25 土2℃）培養(yǎng)的3 個(gè)月大小的植株。選擇生長良好且長勢一致的植株平均分為兩組，一組為處理組（200 mmol·L-1NaCl 處理48 h），另一組為對照組（野生型）。上午10：00，對兩組材料的初生莖節(jié)（1～2 莖節(jié)）、過渡莖節(jié)（3～4 莖節(jié)）和次生莖節(jié)（5～8莖節(jié)）進(jìn)行取樣，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

隨后，用錫箔紙封好迅速放入液氮速凍，-80℃保存，用于后續(xù)RNA 提取，以作為GATA 基因家族組織表達(dá)特異性實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 毛果楊GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定

從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載的擬南芥GATA 家族各基因編碼的氨基酸序列。利用HMMER 軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART軟件對基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，從而鑒定出39個(gè)候選基因。

1.3 毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族染色體定位分析

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）獲得染色體位置，通過軟件MapInspect（http：//www.plant- breeding.wur.nl/UK）［23］來制作染色體定位圖。

1.4 毛果楊GATA轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化分析

運(yùn)用BioEdit 軟件對擬南芥、毛果楊的GATA氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，然后通過進(jìn)化樹軟件MEGA6.0，運(yùn)用相鄰連接法（neighbor joining），執(zhí)行參數(shù)為Poission correction、pairwise deletion 和bootstrap 1 000 次重復(fù)［23］，構(gòu)建毛果楊和擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)的分析

基因內(nèi)含子和外顯子模式圖用GSDS 網(wǎng)站繪制，內(nèi)含子外顯子信息下載于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）和SGN（https：//solgenomics.net/）［23］。

1.6 毛果楊GATA轉(zhuǎn)錄因子家族保守原件分析

通過在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/）預(yù)測蛋白保守基序［23］。

1.7 毛果楊GATA轉(zhuǎn)錄因子家族保守結(jié)構(gòu)域分析

利用序列分析軟件BioEdit 分析蛋白保守域序列［23］。

1.8 毛果楊GATA 基因qRT-PCR分析

根據(jù)毛果楊GATA 家族各基因序列設(shè)計(jì)特異定量引物（見表1），利用CTAB 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析。體系如下：2×TransStart?TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、PtrIDP1-QF/QR 混合引物（10.0 μmol·L-1）0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye（50x）0.4 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：94℃30 s；94℃5 s，60℃15 s，72℃35 s，40次循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，利用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1 毛果楊GATA家族基因qRT-PCR的引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR of P.trichocarpa GATA family

續(xù)表1 Continued table 1

2 結(jié)果分析

2.1 PtrGATA 家族成員基本信息及其在染色體上的分布

利用擬南芥中已鑒定的30 個(gè)GATA 基因編碼氨基酸序列在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫中同源比對篩選到39 個(gè)PtrGATA 基因，根據(jù)擬南芥直系同源基因?qū)?yīng)分別命名為PtrGATA1.1-PtrGATA19.1。PtrGATA 家族各成員基因及其編碼蛋白的基本信息分析表明，各成員CDs 長度變化范圍內(nèi)402～1 659 bp，編碼蛋白的氨基酸序列長度為133～552 aa、分子量為12 867.23～61 305.85 Da、等電點(diǎn)4.87～9.77（見表2）。上述結(jié)果表明，PtrGATA 家族基因及其編碼蛋白基本特性存在較大變化，預(yù)示家族各成員的生物學(xué)功能可能也產(chǎn)生了分化。

表2 毛果楊GATA家族各基因概況Table 2 Summary of GATA genes in P.trichocarpa

基于PtrGATA家族成員基因組的基本信息，我們對PtrGATA 家族成員在毛果楊染色體上的分布情況進(jìn)行了分析，結(jié)果（見表2，圖1）表明，PtrGATA家族在19 條染色體呈不均勻分布，其中5 號染色體上分布了6 個(gè)PtrGATA 基因；2 號和7 號染色體均分布4 個(gè)PtrGATA 基因；1 號、3 號和10 號染色體上分布了3 個(gè)PtrGATA 基因；4 號、6 號、8 號、14 號、17 號和18 號染色體各分布2 個(gè)PtrGATA 基因；9 號和19 號染色體各自分布一個(gè)基因；11 號、12 號、15號和16 號染色體上無PtrGATA 分布。上述結(jié)果表明，毛果楊中PtrGATA基因的擴(kuò)增模式為分散復(fù)制與片段復(fù)制。

2.2 毛果楊PtrGATA家族的系統(tǒng)進(jìn)化

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹將基因分類對于基因家族各成員功能預(yù)測與相互關(guān)系分析極為重要。由于擬南芥GATA 家族各基因研究較多，因此本項(xiàng)研究將結(jié)合擬南芥GATA 家族進(jìn)化信息對毛果楊初步分析。為此，利用MEGA 6.0 軟件制作了69 個(gè)GATA 轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列（毛果楊39 個(gè)，擬南芥中30 個(gè)）進(jìn)化樹，如圖2 所示，毛果楊39 個(gè)GATA基因分成4 個(gè)亞族，其中亞族Ⅰ包含為：PtrGA?TA1.1、 PtrGATA1.3、 PtrGATA2.3、 PtrGATA3.2、PtrGATA4.1、PtrGATA4.2、PtrGATA5.2、PtrGATA5.3、PtrGATA6.2、PtrGATA7.1、PtrGATA8.1、PtrGATA9.1、PtrGATA10.2、PtrGATA13.1、PtrGATA14.1、PtrGA?TA18.1、PtrGATA19.1 和PtrGATAT.1；亞 族Ⅱ?yàn)椋篜trGATA2.4、PtrGATA3.3、PtrGATA5.1、PtrGATA5.4、PtrGATA6.1、PtrGATA7.2、PtrGATA8.2、PtrGATA10.1、PtrGATA14.2 和PtrGATA18.2；亞 族Ⅲ為：PtrGA?TA2.1、PtrGATA2.2、PtrGATA5.5、PtrGATA5.6、PtrGA?TA7.3、PtrGATA7.4、PtrGATA10.3、PtrGATA17.1 和PtrGATA17.2；亞族Ⅳ：PtrGATA1.2 和PtrGATA3.1。毛果楊GATA 家族成員被分成了4 個(gè)亞家族和擬南芥一致［8］，且各亞族同源性較高，暗示著毛果楊和擬南芥的直系同源基因具有相似功能。

2.3 毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序的分析

為進(jìn)一步分析毛果楊GATA 家族各基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的特征，我們利用在線軟件MEME預(yù)測了毛果楊39 個(gè)GATA 轉(zhuǎn)錄因子的保守基序（見圖3A），參數(shù)設(shè)置為：保守基序最佳匹配長度為6～100，保守基序個(gè)數(shù)為10，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。利用在線網(wǎng)站GSDS繪制毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)示意圖（見圖3B）。毛果楊GATA家族不同亞族基序分布如下：亞族中毛果楊GATA轉(zhuǎn)錄因子具有相似的保守基序（見圖3A），比如在Ⅰ亞族中，除了含有特有的Motif 1 基序，還含有Motif 2、Motif 4、Motif 6 和Motif 9 基序。在Ⅳ亞族中，除了含有Motif 1 基序之外，還含有Motif 3、Mo?tif 5 基序。這說明不同亞族中蛋白基序的不同可能是其功能的分化的原因或動(dòng)力。同時(shí)，在相同亞族中GATA 轉(zhuǎn)錄因子相似的保守基序表明其含有相似的功能；內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖是基于毛果楊GATA 的CDS 序列和DNA 序列之間的關(guān)系，毛果楊GATA 基因從1 個(gè)外顯子（PtrGATA17.2）到11個(gè)外顯子（PtrGATA7.4）的結(jié)構(gòu)變化，毛果楊第Ⅰ亞族中每個(gè)基因的內(nèi)含子平均個(gè)數(shù)是最少的（2.3個(gè)），在Ⅳ亞族中最多（8 個(gè)）。在同一亞族家族成員中，內(nèi)含子個(gè)數(shù)差異不大，且在同一亞族中具有相似的結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)上的變化暗示著其基因組可能在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了變化（見圖3B）。

2.4 毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族保守結(jié)構(gòu)域分析

為了進(jìn)一步分析39 個(gè)毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的結(jié)構(gòu)，我們使用DNAMAN 進(jìn)行了氨基酸序列比對。序列比對結(jié)果表明（見圖4）：大多數(shù)毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子都包含C-X2-C-X17-20-CX2-C鋅指結(jié)構(gòu)域，其中第Ⅰ、第Ⅱ和第Ⅲ亞族的鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镃-X2-C-X18-C-X2-C，第Ⅲ亞族的鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镃-X2-C-X20-C-X2-C，沒有發(fā)現(xiàn)C-X2-CX17-C-X2-C 鋅指結(jié)構(gòu)域。其中第Ⅲ亞族的PtrGA?TA7.3 無C-X2，沒有完整的保守結(jié)構(gòu)域；第Ⅵ亞族的PtrGATA1.2 和PtrGATA3.1 無C-X2-C-X20-C-X2-C，沒有保守結(jié)構(gòu)域，可能是在進(jìn)化上發(fā)生了變化。該序列特征與在擬南芥中的研究一致。另外，毛果楊GATA 鋅指結(jié)構(gòu)域的大部分氨基酸位點(diǎn)是高度保守的。亞族與亞族之間的氨基酸位點(diǎn)也是較為保守，例如，Cys-3、Cys-6、Thr-13、Pro-14、Gly-19和Pro-20，以及第二個(gè)半胱氨酸對的側(cè)翼序列（LCNACG）。分析發(fā)現(xiàn)，該家族在整體上具有較強(qiáng)的保守性。可以看出，毛果楊PtrGATA1.2 和PtrGATA3.1 這2 個(gè)成員與其他37 個(gè)成員在保守性上有一定差異，親緣關(guān)系較其他成員較遠(yuǎn)，表明這些成員在進(jìn)化演變中在保守域上發(fā)生了一定的改變。

2.5 毛果楊GATA 基因家族組織表達(dá)特異性分析

為了研究GATA 家族各基因在毛果楊不同組織的功能，我們利用MeV 軟件對phytozome 網(wǎng)站中39 個(gè)GATA 基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量繪制色溫圖并進(jìn)行分析，結(jié)果（見圖5）表明，39 個(gè)GATA 基因在各組織表達(dá)量存在差異，如除PtrGATA5.2 在各個(gè)組織中表達(dá)量都較低外，其余38 個(gè)基因在檢測的組織中均有較明顯的表達(dá)。大部分基因的表達(dá)具有組織特異性，如第Ⅰ亞族、第Ⅲ亞族和第Ⅵ亞族中個(gè)各家族成員均在莖部相對表達(dá)量較高，暗示了同一亞族親緣關(guān)系可能比較相近，在植物生長過程中發(fā)揮的功能相似；第Ⅱ亞族中各家族成員基因組織偏愛性表達(dá)明顯在葉部，相比較其他組織部位，葉部表達(dá)量較高。特別是PtrGA?TA8.2、PtrGATA14.2和PtrGATA18.2三個(gè)基因，大量文獻(xiàn)報(bào)道GATA 家族轉(zhuǎn)錄因子參與了光相關(guān)的調(diào)節(jié)過程，而葉片是植物進(jìn)行光合作用以及光應(yīng)激的主要器官，暗示著第Ⅱ亞族中的基因可能參與了光相關(guān)的調(diào)節(jié)，如光響應(yīng)調(diào)控和葉綠素合成。

2.6 鹽處理對毛果楊GATA 家族基因在各莖節(jié)表達(dá)的影響

為了研究PtrGATA 家族各基因是否在鹽脅迫中具有一定的生物學(xué)功能，我們利用qRT-PCR 檢測了各基因在鹽脅迫下不同發(fā)育莖段中的表達(dá)變化情況，結(jié)果（見圖6A）表明，PtrGATA5.1、PtrGA?TA5.2、PtrGATA7.2、PtrGATA10.2、PtrGATA17.1 和PtrGATA17.2 基因脅迫處理后表達(dá)量無明顯變化；PtrGATA1.1、PtrGATA1.2、PtrGATA2.3、PtrGATA2.4、PtrGATA3.1、PtrGATA3.3、PtrGATA6.1、PtrGATA7.3和PtrGATA14.1 基因脅迫處理后表達(dá)量變化較??；PtrGATA4.1、PtrGATA5.4、PtrGATA5.6、PtrGATA9.1、PtrGATA10.1、 PtrGATA10.3、 PtrGATA19.1 和PtrGATAT.1 基因脅迫處理后在初生莖節(jié)表達(dá)量明顯變化，其中PtrGATA10.1 表達(dá)量變化最為明顯，是對照的6.4 倍（見圖6B）；PtrGATA1.3、PtrGA?TA2.2、PtrGATA3.2、PtrGATA4.2、PtrGATA5.5、PtrGA?TA6.2、PtrGATA8.1、PtrGATA8.2、PtrGATA13.1、PtrGA?TA14.2、PtrGATA18.1和PtrGATA18.2基因脅迫處理后在過渡莖節(jié)表達(dá)量明顯變化，其中PtrGATA18.1鹽脅迫處理后在莖部整體表達(dá)量變化最為明顯，過度莖節(jié)最明顯，是對照的35.6 倍（見圖6C）；PtrGATA2.1、PtrGATA5.3、PtrGATA7.1和PtrGATA7.4基因脅迫處理后在次生莖節(jié)表達(dá)量明顯變化，其中PtrGATA5.3 表達(dá)量變化最為明顯，是對照的18.2 倍（見圖6D）。表明毛果楊GATA 基因可能通過復(fù)雜的機(jī)制參與植物鹽脅迫適應(yīng)過程。

3 討論

隨著植物基因組研究的深入，利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過廣泛的基因家族分析，奠定基因功能研究的基礎(chǔ)，成為現(xiàn)今基因功能研究的熱點(diǎn)。研究植物基因家族中基因的分布、基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析，對進(jìn)一步研究其在植物生長發(fā)育及抗性響應(yīng)中的功能具有重要意義。GATA 轉(zhuǎn)錄因子是一類廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，具有特殊的鋅指結(jié)構(gòu)，根據(jù)前人對擬南芥［7］、蓖麻［8］、蘋果［9］、水稻［10］、番茄［11］和辣椒［12］等植物的研究發(fā)現(xiàn)，除水稻分為7 個(gè)亞族外，其他均分成4 個(gè)亞族，在光響應(yīng)調(diào)控和葉綠素合成［13～16］、細(xì)胞分裂素響應(yīng)［17～18］、花發(fā)育［19］和種子萌發(fā)［20］等多個(gè)生物學(xué)過程中扮演著重要角色。GATA 家族的大部分氨基酸位點(diǎn)在大部分成員中是高度保守的，這與本研究中毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子的家族成員的保守性，基本相符。

本研究對毛果楊GATA 家族39 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。染色體定位分析表明，毛果楊GATA 轉(zhuǎn)錄因子不均勻的分布在15 條染色體上。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，毛果楊GATA 家族成員被分成了4 個(gè)亞家族，這一點(diǎn)與擬南芥［7］相同，可根據(jù)擬南芥各亞族GATA 基因功能來推測毛果楊相應(yīng)GATA 基因的功能。基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析結(jié)果表明，在同一亞族的GATA 基因含有同類型的蛋白保守基序和相同數(shù)量的內(nèi)含子，表明同一亞組的基因可能具有相似的功能和結(jié)構(gòu)，而不同亞家族間存在的差異可能是進(jìn)化中發(fā)生變化導(dǎo)致的。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，毛果楊GATA 家族在整體上具有較強(qiáng)的保守性，除了第Ⅳ亞家族外，其他亞族都含有共同的保守區(qū)域。組織表達(dá)特異性分析表明，第Ⅰ亞族、第Ⅲ亞族和第Ⅵ亞族中各個(gè)家族成員均在莖部相對表達(dá)量較高，第Ⅱ亞族中各家族成員基因組織偏愛性表達(dá)明顯在葉部，說明同一亞族親緣關(guān)系可能比較相近，在植物生長過程中發(fā)揮的功能可能相似。此外，GATA 基因在植物中普遍表達(dá)，在細(xì)胞的發(fā)育分化、生長增殖和分解凋亡等許多重要的生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色。已有研究表明，一些與逆境相關(guān)的鋅指蛋白基因，具有對植物的抗逆性調(diào)控的功能［24～26］。通過鹽脅迫處理發(fā)現(xiàn)，GATA 基因家族成員在不同發(fā)育階段的莖部表達(dá)存在明顯差異；同時(shí)鹽脅迫處理后，大部分基因表達(dá)量變化顯著，其中PtrGATA10.1、PtrGATA18.1和PtrGATA5.3分別在鹽脅迫后的初生莖節(jié)、過度莖節(jié)和次生莖節(jié)表達(dá)量顯著性升高。這說明毛果楊GATA 家族基因可能參與楊樹莖的發(fā)育與鹽脅迫響應(yīng)。

綜上所述，本研究對鑒定出的39 個(gè)PtrGATA家族基因進(jìn)行了染色體定位、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系以及表達(dá)模式分析，為今后進(jìn)一步研究該家族基因奠定了一定基礎(chǔ)。