胡文海 閆小紅 李曉紅 曹灶桂

（1. 井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉安 343009；2. 江西省生物多樣性與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉安 343009）

干旱是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響最大的氣候?yàn)?zāi)害，嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育［1］。植物光合作用極易受到環(huán)境脅迫的影響，干旱引起氣孔關(guān)閉和Calvin循環(huán)中關(guān)鍵酶活性的降低，從而限制了光合碳同化的進(jìn)行，導(dǎo)致光合電子傳遞鏈的過(guò)度還原和過(guò)剩激發(fā)能的產(chǎn)生，造成植物光抑制甚至光合機(jī)構(gòu)的破壞［2～3］。

快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（OJIP 曲線）反映了PSⅡ的原初光化學(xué)反應(yīng)及光合機(jī)構(gòu)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)等變化［4～5］。快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析（JIP-test）是以生物膜能量流動(dòng)為基礎(chǔ)建立的分析方法，通過(guò)JIP-test 分析能夠獲得環(huán)境條件對(duì)光合機(jī)構(gòu)主要是PSⅡ供體側(cè)、受體側(cè)和PSⅡ反應(yīng)中心的影響［5］。研究表明，干旱脅迫導(dǎo)致小麥葉片OJIP 曲線發(fā)生變化，造成PSⅡ反應(yīng)中心失活，PSⅡ受體側(cè)QA傳遞電子的能力和質(zhì)體醌（PQ）庫(kù)接受電子的能力下降；同時(shí)反應(yīng)中心熱耗散能力得到促進(jìn)，對(duì)電子傳遞鏈起到一定的保護(hù)作用［6］。干旱脅迫也導(dǎo)致沙棗和孩兒拳頭PSⅡ反應(yīng)中心［7］，白榆放氧復(fù)合體［8］受到一定程度的破壞。

油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids，BRs）可以提高作物對(duì)各種生物和非生物脅迫的抗性，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用［9］。已有的研究表明，BRs能夠改善干旱脅迫下辣椒葉片的光合碳同化和PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)，并促進(jìn)PSⅡ天線色素?zé)岷纳⒛芰Φ脑鰪?qiáng)以緩解干旱光抑制對(duì)光合機(jī)構(gòu)的傷害［10］。但是利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)技術(shù)，探究BRs 對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心以及光合電子傳遞鏈的影響仍較少。本研究以辣椒為材料，研究外源BRs對(duì)干旱脅迫下辣椒葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)特性的影響，探討B(tài)Rs提高作物耐旱性的光合生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

供試?yán)苯凡牧蠟槌? 號(hào)（Capsicum annuum L.cv Chaola No.9）。將辣椒種子播種于裝有草碳土的30 cm×30 cm 塑料花盆中，置于連棟大棚中培養(yǎng)，澆灌園試營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水肥管理。植株長(zhǎng)至20～25 葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株移入含500 mL園試營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，適應(yīng)7 d 后進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)期間溫度范圍為18～28℃，最大光照強(qiáng)度約600 μmol·m-2·s-1。

采用0.1 μmol·L-1的24-表油菜素內(nèi)酯（EBR，Sigma 公司）對(duì)植株葉片上下均勻噴施進(jìn)行BRs 處理，采用15%的PEG6000 模擬干旱脅迫。試驗(yàn)共設(shè)4 處理：①對(duì)照處理（CK）：葉片噴施清水，培養(yǎng)在園試營(yíng)養(yǎng)液中；②EBR 處理（EBR）：葉片噴施0.1 μmol·L-1的EBR，培養(yǎng)在園試營(yíng)養(yǎng)液中；③模擬干旱處理（D）：葉片噴施清水，培養(yǎng)在PEG6000 濃度為15%的園試營(yíng)養(yǎng)液中；④模擬干旱和EBR 協(xié)同處理（D+EBR）：葉片噴施0.1 μmol·L-1的EBR，培養(yǎng)在PEG6000濃度為15%的園試營(yíng)養(yǎng)液中。處理第4天選擇成熟葉進(jìn)行OJIP曲線測(cè)定。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.2.1葉片相對(duì)含水量測(cè)定

植株葉片相對(duì)含水量（LRWC）的測(cè)定：先稱(chēng)取葉片鮮重（Mf），然后將葉片完全浸泡在蒸餾水中并置于黑暗中12 h 后稱(chēng)取飽和鮮量（Mt），再將葉片置于烘箱中110℃殺青1 h 后再80℃下48 h 烘干至恒重，稱(chēng)取其干重（Md），并計(jì)算葉片相對(duì)含水量：

1.2.2 OJIP曲線測(cè)定與JIP-test參數(shù)計(jì)算

采用便攜式植物效率儀Handy-PEA（Hansat?ech，英國(guó)）測(cè)定葉片OJIP 曲線。葉片充分暗適應(yīng)30 min后測(cè)定，OJIP曲線由1 500 μmol·m-2·s-1紅光誘導(dǎo)，測(cè)定時(shí)間為1 s。JIP-test 參數(shù)的計(jì)算方法參見(jiàn)李鵬民等［5］和van Heerden 等［11］文獻(xiàn)，相關(guān)參數(shù)及其含義見(jiàn)表1。參照蘇曉瓊等［12］的方法計(jì)算相對(duì)可變熒光（ΔVt）：

式中：ΔK-、ΔJ-和ΔI-band 分別為在300 μs、2 ms和30 ms處測(cè)定的ΔVt。

表1 JIP測(cè)定分析所用的參數(shù)和公式Table 1 Parameters and formulae used in JIP-test anal?ysis

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS11.5 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。采用one-way ANVOA 最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)，在P<0.05 水平上進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，圖表中不同字母表示在5%水平上處理間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)葉片相對(duì)含水量和光合性能的影響

干旱處理4d 導(dǎo)致葉片相對(duì)含水量大幅下降，施用EBR 對(duì)不同處理下葉片相對(duì)含水量沒(méi)有影響；相比對(duì)照而言，干旱處理顯著降低了辣椒葉片F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo和PIABS，EBR 處理則有效緩解了干旱脅迫所引起的這些參數(shù)的下降，而正常水分條件下噴施EBR 對(duì)辣椒葉片F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo和PIABS差異不顯著（P>0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 EBR對(duì)干旱脅迫下辣椒葉片相對(duì)含水量和光合性能的影響Table 2 Effect of EBR on LRWC and photosynthetic per?formance in leaves of pepper under drought stress

2.2 對(duì)葉片OJIP曲線的影響

與對(duì)照相比較，干旱處理導(dǎo)致OJIP 曲線發(fā)生變形，Ⅰ相（30 ms）和P 相（最大熒光）大幅下降；EBR處理可使干旱脅迫下OJIP曲線部分恢復(fù)到對(duì)照線型，而正常水分條件下噴施EBR 對(duì)OJIP 曲線影響不明顯（見(jiàn)圖1A）。將OJIP 曲線標(biāo)準(zhǔn)化后，可以看出EBR 明顯緩解了干旱脅迫下ΔK-band 和ΔJ-band的增高，而正常水分條件下EBR 處理則對(duì)ΔK-band、ΔJ-band 和ΔI-band 沒(méi)有明顯影響（見(jiàn)圖1B）。干旱脅迫下，EBR 處理并未減輕Fo增加，但緩解了Fm的下降；正常水分下EBR 處理則對(duì)Fo和Fm未產(chǎn)生影響（見(jiàn)圖2）。

2.3 對(duì)PSⅡ受體側(cè)的影響

與對(duì)照相比，干旱導(dǎo)致Mo和VJ增加，降低了Sm、ψo(hù)、φEo和φRo，對(duì)VI雖有促進(jìn)但未產(chǎn)生顯著影響；EBR 處理緩解了干旱脅迫下ψo(hù)的降低，對(duì)其他參數(shù)雖有改善但與干旱處理間差異不顯著（P>0.05）。而正常水分處理下EBR 處理未引起這些參數(shù)的明顯變化（見(jiàn)表3）。

2.4 對(duì)比活性參數(shù)的影響

由表4 可知，與對(duì)照相比較，干旱處理降低了RC/CS、ABS/CS、TRo/CS 和ETo/RC，增加了DIo/CS；EBR 處理則緩解了干旱脅迫下RC/CS、ABS/CS、TRo/CS 和ETo/CS 的降低，但DIo/CS 仍保持與干旱處理相同的程度。然而，干旱促進(jìn)了ABS/RC、TRo/RC 和DIo/RC 的增加，分別比對(duì)照增加了22.1%、10.3%和62.7%，但并未影響ETo/RC；EBR 處理對(duì)干旱脅迫下TRo/RC 的增加略有緩解外，其他參數(shù)均與干旱處理無(wú)顯著差異。正常水分處理下EBR處理未引起這些參數(shù)的明顯變化。

表3 EBR對(duì)干旱脅迫下辣椒葉片Mo、VJ、VI、Sm、ψo(hù)、φEo和φRo的影響Table 3 Effect of BR on Mo，VJ，VI，Sm，ψo(hù)，φEoand φRo in leaves of pepper under drought stress

表4 EBR對(duì)干旱脅迫下辣椒葉片比活性參數(shù)的影響Table 4 Effect of EBR on specific energy fluxes in leaves of pepper under drought stress

3 討論

光合作用是對(duì)逆境最為敏感的生理過(guò)程之一。逆境脅迫下當(dāng)光合機(jī)構(gòu)吸收的光能超過(guò)其所能利用的數(shù)量時(shí)，過(guò)剩光能引起光合活性降低，導(dǎo)致光抑制發(fā)生，通常植物光抑制程度用Fv/Fm表示［13］。利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)技術(shù)獲得的光合性能指數(shù)（PIABS）對(duì)某些脅迫的敏感性高于Fv/Fm，能更好地反映脅迫對(duì)光合機(jī)構(gòu)的影響［5，11］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干旱處理導(dǎo)致了辣椒葉片F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo和PIABS的下降，而EBR 處理則有效緩解了這些參數(shù)的下降，這說(shuō)明干旱脅迫降低了辣椒葉片的光化學(xué)效率和光合性能，EBR 處理對(duì)干旱脅迫下辣椒葉片光合機(jī)構(gòu)和光合性能具有保護(hù)作用，減輕了干旱光抑制程度。

快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線包含了大量關(guān)于PSⅡ反應(yīng)中心原初光化學(xué)反應(yīng)信息，通過(guò)對(duì)曲線的分析可以深入了解環(huán)境條件對(duì)光合機(jī)構(gòu)，主要是PS Ⅱ供體側(cè)、受體側(cè)和反應(yīng)中心的影響［4～5，14］。OJIP 曲線中J 相反映了QA-的第一次瞬間最大積累，J 相熒光上升意味著PSⅡ受體側(cè)QA到QB間的電子傳遞受阻［15～16］。如果在OJIP 曲線上升至J相前出現(xiàn)K點(diǎn)，則反映了PSⅡ供體側(cè)放氧復(fù)合體（OEC）受到損傷［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EBR 處理可有效緩解干旱脅迫下辣椒葉片ΔK-band 和ΔJ-band 的上升，這說(shuō)明干旱脅迫既損傷了辣椒葉片PSⅡ供體側(cè)OEC，同時(shí)也抑制了受體側(cè)的電子傳遞，而EBR 處理對(duì)PSⅡ供體側(cè)和受體側(cè)均起到了保護(hù)作用［12，18］。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，F(xiàn)v/Fm的下降主要是由于干旱脅迫導(dǎo)致Fo的增加和Fm的下降所致，這表明干旱脅迫對(duì)辣椒葉片PSⅡ反應(yīng)中心和受體側(cè)均造成傷害，電子傳遞能力明顯下降［12，19］。有研究表明干旱脅迫導(dǎo)致抗旱性弱的小麥品種PSⅡ反應(yīng)中心失活，使得天線色素吸收的光能向PSⅡ的傳遞減少［6］。VJ和VI反映了在J 點(diǎn)和I 點(diǎn)關(guān)閉的反應(yīng)中心數(shù)量，即QA-的積累量［6］。其中VJ增高是PSⅡ受體側(cè)QA向次級(jí)醌受體QB電子傳遞受阻的特異性標(biāo)志，VI增高則表明PQ 庫(kù)接受電子的能力下降［4，20］。干旱脅迫導(dǎo)致小麥PSⅡ受體側(cè)QA向次級(jí)醌受體QB 電子傳遞受阻，同時(shí)也降低了質(zhì)體醌PQ 庫(kù)接受電子的能力［6］。我們的結(jié)果則表現(xiàn)為干旱處理導(dǎo)致VJ的增加，說(shuō)明PSⅡ受體側(cè)QA向QB電子傳遞受阻；然而干旱處理并未對(duì)VI造成影響，說(shuō)明干旱并未影響到質(zhì)體醌PQ 庫(kù)接受電子的能力。這一結(jié)果與原佳樂(lè)等［6］在小麥干旱中的研究結(jié)果不一致，這可能與干旱處理程度和作物種類(lèi)有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，干旱處理降低了ψo(hù)、Sm、φEo和φRo，但促進(jìn)了Mo的上升，這表明干旱脅迫導(dǎo)致有活性的PSⅡ反應(yīng)中心開(kāi)放程度和PQ庫(kù)容量下降，PSⅡ受體側(cè)QA傳遞電子的能力下降。EBR處理促進(jìn)了干旱脅迫下ψo(hù)的恢復(fù)，說(shuō)明EBR 處理改善了干旱脅迫下葉片PSⅡ受體側(cè)的電子傳遞。雖然干旱和EBR 協(xié)同處理下辣椒葉片Mo、VJ、φEo和φRo值與干旱脅迫下葉片的值之間沒(méi)有顯著差異，但這些參數(shù)比干旱處理植株更接近對(duì)照，這表明EBR可能從整體上對(duì)干旱脅迫下辣椒葉片PSⅡ受體側(cè)的電子傳遞具有改善作用。

正常條件下，PSⅡ反應(yīng)中心捕獲的光能轉(zhuǎn)化為激發(fā)能，其中大部分激發(fā)能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能推動(dòng)碳同化，其余部分則以熱的形式耗散掉；然而在逆境脅迫下，PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生可逆失活，失活的PSⅡ反應(yīng)中心能夠吸收光能但并不傳遞給電子傳遞鏈［5，16］。王振山等［21］研究表明，干旱脅迫通過(guò)干擾山葡萄葉片PSⅡ電子供體側(cè)、受體側(cè)以及電子傳遞鏈的功能，嚴(yán)重傷害了葉片光合機(jī)構(gòu)的正常功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，干旱導(dǎo)致葉片單位葉面積有活性的PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)目（RC/CS）顯著減少，單位葉面積吸收的光能（ABS/CS）明顯降低，這意味著干旱脅迫導(dǎo)致了反應(yīng)中心的降解或失活，并減少了天線色素對(duì)光能的捕獲［22～23］。單位葉面積有活性反應(yīng)中心數(shù)目的減少近而使得單位葉面積捕獲的光能（TRo/CS）和進(jìn)行電子傳遞的能量（ETo/CS）下降，同時(shí)誘導(dǎo)了熱耗散（DIo/CS）的增加。這說(shuō)明辣椒遭受干旱脅迫后啟動(dòng)了相應(yīng)的防御機(jī)制，一方面通過(guò)PSⅡ的可逆失活和減少光能吸收以防御光能的過(guò)度積累，另一方面通過(guò)促進(jìn)熱耗散途徑減少過(guò)剩激發(fā)能的積累［5］。然而，干旱脅迫促進(jìn)了單位反應(yīng)中心吸收光能（ABS/RC）、捕獲光能（TRo/RC）和熱耗散（DIo/RC）的增加，這可能是由于干旱使得單位葉面積有活性反應(yīng)中心數(shù)目下降后的補(bǔ)償反應(yīng)，剩余的有活性的反應(yīng)中心效率的提高有利于更好地消耗電子傳遞鏈中的能量［5］。研究表明BRs具有促進(jìn)植物光合作用，并可緩解逆境脅迫對(duì)光合作用的傷害［9，24］。干旱脅迫下EBR 處理緩解了辣椒葉片RC/CS 的減少，以及ABS/CS、TRo/CS和ETo/CS的下降，并且維持較高的DIo/CS。雖然干旱脅迫下EBR 處理減輕了RC/CS的下降，但仍保持了相對(duì)較高ABS/RC、TRo/RC 和DIo/RC。這表明EBR 處理對(duì)干旱脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心具有保護(hù)作用，其原因可能是EBR 促進(jìn)了光合作用和熱耗散的進(jìn)行，防止了光合電子傳遞鏈的過(guò)度還原，從而對(duì)光合電子傳遞鏈和反應(yīng)中心起到保護(hù)作用［10，25］。