董雯雯　張世棟　王春玲　艾洪新　朱偉　李峰

摘? 要：為建立一種能同時快速檢測鴨疫里氏桿菌（RA）和鴨坦布蘇病毒（DTMUV）的PCR方法，根據(jù)NCBI公布的RA dnaB基因和DTMUV PrM基因分別設(shè)計并合成兩對特異性引物，通過對雙重PCR反應(yīng)的引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選。優(yōu)化引物濃度組合為：RA引物0.5 μmol/L，DTMUV引物為1 μmol/L，最佳退火溫度為53 ℃。特異性試驗表明，該方法對鵝細(xì)小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、番鴨細(xì)小病毒、I型鴨肝炎病毒、沙門氏菌、大腸桿菌的核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，RA和DTMUV的檢測結(jié)果為陽性。敏感性測定表明，該雙重PCR方法最低能檢出RA和DNAV-1的核酸量分別為6.7 pg和3.6 pg。本研究建立的檢測方法檢測實驗室保存的8份臨床病料，RA的陽性率為62.5%，DTMUV陽性率為37.5%。綜上所述，建立的PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性和穩(wěn)定性良好，為RA和DTMUV的臨床病料檢測提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：鴨疫里氏桿菌;鴨坦布蘇病毒;雙重PCR;應(yīng)用

中圖分類號：S858.31? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B? ? 文章編號：1673-1085（2021）1-0016-05

鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer， RA）為革蘭氏陰性小桿菌，主要感染1～8周齡雛鴨，引起雛鴨的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等病理變化，又稱傳染性漿膜炎，該病可經(jīng)呼吸道和損傷的皮膚傳染，呈現(xiàn)慢性或急性敗血性過程，該病一年四季均可發(fā)生，病死率約為5%～20%[1-4]。鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus， DTMUV）是黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的一種新型黃病毒，為單股正鏈RNA病毒，可引起雛鴨的共濟(jì)失調(diào)、癱瘓、蛋鴨卵巢出血壞死、嚴(yán)重時可致死。我國于2010年相繼在福建、浙江、江蘇等地區(qū)的蛋鴨中檢出本病毒，該病的臨床癥狀類似于鴨瘟、鴨流感，目前已擴(kuò)大至肉鴨、番鴨、鵝、鴿、麻雀等多種禽類[5]。鴨疫里氏桿菌病和鴨坦布蘇病是近年來危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病原微生物，也可引起雛鴨混合感染，導(dǎo)致雛鴨大批感染死亡，嚴(yán)重影響我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

目前針對以上兩種常見疾病的實驗室診斷方法主要有細(xì)菌、病毒的分離鑒定、生理生化鑒定、形態(tài)觀察、血清中和試驗、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗等[7]。這些方法在檢測過程中耗時費(fèi)力，成本較高。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種新型DNA擴(kuò)增技術(shù)，在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對或兩對以上特異性引物，實現(xiàn)同時擴(kuò)增出多種病原微生物核酸片段的PCR反應(yīng)，在臨床上混合感染疾病的鑒別診斷方面具有較高的優(yōu)勢和應(yīng)用價值[8-10]。由于RA和DTMUV均可感染低日齡肉鴨及蛋鴨，且存在混合感染。為此，本研究針對RA和DTMUV的保守序列設(shè)計并合成兩對特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)及體系建立了RA和DTMUV的雙重PCR檢測方法，為這兩種病毒的臨床感染快速檢測提供技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 毒株? 試驗毒株：RA、DTMUV、鵝細(xì)小病毒（GPV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、番鴨細(xì)小病毒（MDPV）、I型鴨肝炎病毒（DHV-I）、沙門氏菌（SE）、大腸桿菌（E.coil）均由本單位保存。

1.2? 主要試劑? 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;病毒DNA/RNA提取試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司;2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker均購自北京TIANGEN公司;cDNA第一鏈合成試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3? 核酸提取和cDNA合成? RA核酸、DTMUV尿囊液及8份臨床疑似病料的核酸提取，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4? 引物設(shè)計? 根據(jù)NCBI公布的鴨疫里氏桿菌dnaB基因和鴨坦布蘇病毒PrM基因的保守核苷酸序列設(shè)計引物，引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5? 單一PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定? 分別以RA DNA及病毒cDNA為模板進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min，4 ℃終止。取反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，以120 V恒壓于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，并將擴(kuò)增條帶送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.6? 雙重PCR的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化? RA和DTMUV cDNA各取0.5 μL混合作為雙重PCR模板，分別進(jìn)行引物濃度和退火溫度的優(yōu)化。退火溫度優(yōu)化反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，混合模板DNA 1μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL，退火溫度設(shè)置8個溫度梯度，分別為49、49.2、49.6、50.5、51.6、53、54.7、56.1 ℃。引物濃度優(yōu)化反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，混合模板1 μL，引物濃度的組合見表2;最后補(bǔ)充ddH2O至20 μL。

1.7? 特異性試驗? 為檢測建立方法的特異性，以鴨中常見的GPV、AIV、NDV、MDPV、DHV-I、SE、E.coil核酸作為模板，在建立的雙重PCR體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時以RA及DTMUV核酸的混合液作為模板設(shè)立陽性對照，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測。

1.8? 敏感性試驗? 對提取的核酸分別檢測濃度，將提取的RA及DTMUV核酸分別進(jìn)行2倍倍比濃度梯度稀釋：1×20、1×2-1、1×2-2、1×2-3、1×2-4、1×2-5、1×2-6、1×2-7，8個稀釋梯度，每個梯度各取0.5 μL混合作為PCR反應(yīng)模板，然后用優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳，對該方法的敏感性進(jìn)行檢測。

1.9? 雙重PCR方法的重復(fù)性? 對RA、DTMUV、RA+DTMUV的核酸進(jìn)行多次重復(fù)性檢測，以驗證該檢測方法的穩(wěn)定性。

1.10? 臨床樣品的檢測? 利用已建立好的雙重PCR方法，對本單位保存的可疑病料進(jìn)行檢測。

2? 結(jié)果

2.1? 單一PCR擴(kuò)增? 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，本試驗設(shè)計的引物能夠分別特異性擴(kuò)增出RA dnaB基因和DTMUV PrM基因，擴(kuò)增片段大小為431 bp和250 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖1。

2.2? 雙重PCR方法的建立及反應(yīng)條件優(yōu)化? 對雙重PCR退火溫度和引物濃度優(yōu)化結(jié)果表明，最佳退火溫度為53 ℃，見圖2。最佳引物濃度組合為：RA dnaB F/R 0.5 μmol/L， DTMUV PRM F/R 1.0 μmol/L，見圖3。PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s，54.7 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min，4 ℃反應(yīng)結(jié)束。

2.3? 特異性試驗? 通過前期優(yōu)化的雙重PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系分別對RA及DTMUV的混合模板、RA、DTMUV、GPV、AIV、NDV、MDPV、DHV-I、SE及E.coil單一模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明本試驗建立的雙重PCR方法能夠有效檢測出RA、DTMUV核酸，且對其他病原微生物核酸檢測結(jié)果全為陰性，表明建立的雙重PCR特異性良好，特異性試驗結(jié)果見圖4。

2.4? 敏感性試驗? 采用前期優(yōu)化的雙重PCR反應(yīng)條件及體系，以RA、DTMUV核酸為模板，2倍倍比稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明：RA、DTMUV的核酸最低檢出量分別為6.7 pg和3.6 pg，表明本試驗建立的多重PCR方法具有較好的敏感性。敏感性試驗結(jié)果見圖5。

2.5? 雙重PCR方法的重復(fù)性? 利用前期建立的雙重PCR方法對RA+DTMUV、RA、DTMUV核酸進(jìn)行多次重復(fù)性檢測，結(jié)果表明：以上核酸均能擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相一致的目的片段，表明該方法穩(wěn)定性良好，見圖6。

2.6? 臨床樣品的檢測? 采用建立好的雙重PCR方法對本單位保存好的臨床病料進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，8份臨床病料中RA的檢出率為62.5%，DTMUV的檢出率為37.5%，見圖7。

3? 討論

隨著中國水禽養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，及時準(zhǔn)確檢測和診斷水禽病毒病是疫病監(jiān)測和防控的重中之中。當(dāng)前，水禽病毒病的檢測診斷主要依靠臨床癥狀、病理變化、血清學(xué)、常規(guī)PCR檢測等方法[11]，適應(yīng)于檢測單一感染，然而水禽病毒病常常表現(xiàn)為混合感染，常規(guī)檢測難以準(zhǔn)確判定。RA和DTMUV是危害水禽業(yè)健康發(fā)展的重要病原微生物，不僅存在單一感染，混合感染也屢見報道[2，6，12-17]。同時快速檢測這兩種病原微生物具有重要的臨床意義，而本試驗建立了一種雙重 PCR 方法，對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均經(jīng)過優(yōu)化，敏感性高，最低能檢出 6.7 pg RA和3.6 pg DTMUV。

相較于單一PCR，多重PCR由于在同一反應(yīng)體系中加入多對特異性引物和多種核酸模板，因此反應(yīng)條件要求相對較高[18]。一般來說，多重PCR方法的建立主要受反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度、退火溫度等幾種因素的影響，而引物濃度是多重PCR成功的關(guān)鍵之處，可直接影響到多重PCR的擴(kuò)增結(jié)果。本次試驗所建立的雙重PCR方法使用的是2xTaq PCR Master Mix，因此，針對本反應(yīng)體系，僅針對退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選即可。本研究中以RA dnaB基因和DTMUV PrM基因保守序列為參考設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增大小分別為431 bp和250 bp，兩者產(chǎn)物大小差異較為明顯，可以在瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行區(qū)分。退火溫度從49～56.1 ℃分別進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示退火溫度在53 ℃時， RA 引物為0.5 μmol/L、DTMUV 引物為1.0 μmol/L時反應(yīng)達(dá)到最佳效果;在敏感性試驗過程中，模板梯度濃度均采取了2倍倍比稀釋，經(jīng)檢測，該雙重PCR最低能同時檢測到RA 6.7 pg和DTMUV 3.6 pg的核酸模板，靈敏度較高。本研究建立的RA和DTMUV雙重PCR方法，獲得兩種產(chǎn)量較高、特異性好、純度高的產(chǎn)物，操作簡單、省時省力，該方法的建立為DTMUV和DPV早期診斷提供了重要的方法，可為這兩種病毒混合感染番鴨的臨床病例的快速檢測提供技術(shù)支撐。

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