方 侃，呂光輝，汪新體，艾志兵，王啟斌

(湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知功能障礙為主要特征的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，其病理學特征為神經元外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑、神經元內異常磷酸化Tau蛋白聚集形成神經原纖維纏結及大腦皮質、海馬膽堿能神經元大量丟失伴膠質細胞增生等[1-2]，通常經歷了主觀認知功能下降期、輕度認知功能障礙期及癡呆期3個階段。而輕度認知功能障礙是介于正常認知和癡呆之間的一種認知缺損的過渡狀態(tài)，具有轉化為AD的高度危險性。目前AD療效差的主要原因是干預時機太晚和措施單一，在明確AD診斷時認知損害已不可逆轉[3]。廿二碳六烯酸(DHA)是不飽和脂肪酸家族中最重要的成員，其可通過多種機制來防治AD[4-6]。有研究表明，有氧運動干預可以延緩AD認知功能下降的速度[7-9]。因此，本研究嘗試建立具有臨床輕度認知功能障礙特征的動物模型，試圖從輕度認知功能障礙階段進行早期干預，探討DHA聯合有氧運動干預對輕度認知功能障礙模型小鼠學習記憶能力的影響及其機制，從而為有效預防AD的發(fā)生提供實驗數據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康雄性昆明小鼠100只，16月齡，體質量50～55 g，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心[SYXK(鄂)2016-0031]提供，生產許可證號：SCXK(鄂)2016-0008。本課題經湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院倫理委員會審查備案。實驗前將小鼠適應性喂養(yǎng)1周，自由飲食，濕度50%～60%，室溫(22±2)℃，光照12 h/d。

1.2實驗儀器及試劑 MT-200水迷宮行為學跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟)；SA101小動物跑臺(江蘇賽昂斯)。D-半乳糖 (美國Amresco公司)；DHA[梯希愛(上海)化成公司]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)檢測試劑盒(武漢博士德公司，比色法)。膽堿乙酰轉移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、β淀粉樣蛋白42(Aβ42)及磷酸化Tau蛋白(P-tau) 酶聯免疫吸附試驗試劑盒(美國elabscience公司)。改良Bielschowsky神經染色液(武漢卡諾斯公司)。

1.3實驗動物分組及模型復制 按數字表法將小鼠隨機分為對照組、模型組、有氧運動組、DHA組、聯合組，每組20只。模型組、有氧運動組、DHA組、聯合組小鼠連續(xù)4周腹腔注射D-半乳糖120 mg/(kg·d)和灌胃三氯化鋁35 mg/(kg·d)建立輕度認知功能障礙模型，對照組腹腔注射相應劑量的生理鹽水和灌胃相應劑量的生理鹽水。

1.4干預措施

1.4.1跑臺運動干預 對有氧運動組、聯合組小鼠實施有氧運動干預。①適應性跑臺訓練：第1天運動速度為12 m/min，訓練時間為20 min；隨后4 d運動速度不變，訓練時間每天增加10min，直至60 min/d。②正式跑臺運動訓練：坡度為0°，第1周運動速度設定為15 m/min，以后每周增加3 m/min，直至24 m/min；連續(xù)4周，每周訓練5 d，每天訓練60 min。另3組小鼠在同時間點放在跑臺上自由運動相應的時間。

1.4.2DHA干預 對DHA組、聯合組小鼠腹腔注射 DHA 360 mg/(kg·d)，連續(xù)4周；另3組小鼠同時間點腹腔注射同劑量的生理鹽水。

1.5檢測指標及方法

1.5.1Morris水迷宮實驗 ①定位航行實驗：隨機從不同象限將小鼠面對池壁輕輕放入水中，記錄小鼠找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期；若小鼠60 s內未找到平臺，則將該小鼠放在平臺上停留15 s，計其逃避潛伏期為60 s，連續(xù)4 d。②空間探索實驗：定位航行實驗結束后次日，撤除平臺，記錄小鼠穿越原平臺位置的次數和在各象限探索的時間百分比(目標象限/對立象限)。

1.5.2取材及處理 水迷宮實驗結束后，斷頭取腦，迅速分離并取下海馬組織。各組20只小鼠的一側海馬組織(左側或右側，隨機)裝入EP管，投入液氮中，用于酶聯免疫吸附試驗等檢測；而另一側海馬組織投入4%多聚甲醛溶液中固定，用于改良Bielschowsky神經染色液染色(簡稱銀染)標本的制作。

1.5.3海馬組織氧化應激指標、ChAT、AChE及Aβ42/P-tau測定 從液氮中取出海馬組織，平衡溫度后稱質量，按質量/體積比(1∶9)加入4 ℃生理鹽水，用組織勻漿器制作成10%的海馬組織勻漿；置于離心機(轉速3 000 r/min、半徑13.5 cm)中離心15 min，取上清液分裝于EP管。按試劑盒說明, 用比色法檢測海馬組織中SOD、GSH-Px活性及MDA水平；按試劑盒說明，用酶聯免疫吸附法(美國熱電Multiskan MK3全自動酶標儀)檢測海馬組織中ChAT、AChE活性和Aβ42、P-tau含量。

1.5.4海馬組織改良Bielschowsky神經染色液染色 先制作海馬組織石蠟切片，切片厚10 μm；再按照改良Bielschowsky神經染色液使用說明書進行操作,將切片浸染于銀溶液中，之后用還原劑處理，使神經元、軸突及神經纖維呈現深棕色或黑色。

2 結 果

2.1各組小鼠Morris水迷宮行為學測試比較 與對照組比較，模型組逃避潛伏期延長,穿越原平臺位置次數減少,目標象限空間探索時間百分比降低,對立象限空間探索時間百分比提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與模型組比較，有氧運動組、DHA組、聯合組逃避潛伏期縮短,穿越原平臺位置次數增加,空間探索時間百分比目標象限提高而對立象限降低，且聯合組變化最明顯，DHA組次之，有氧運動組再次之，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；聯合組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠Morris水迷宮行為學測試比較

2.2各組小鼠海馬組織中氧化應激指標水平比較與對照組比較，模型組SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與模型組比較，有氧運動組、DHA組、聯合組SOD、GSH-Px活性升高，MDA水平降低，且聯合組變化最明顯，DHA組次之，有氧運動組再次之，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；聯合組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠海馬組織中氧化應激指標水平比較

2.3各組小鼠海馬組織中ChAT、AChE活性和Aβ42、P-tau含量比較 與對照組比較，模型組ChAT活性降低，AChE活性及Aβ42、P-tau含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與模型組比較，有氧運動組、DHA組、聯合組ChAT活性升高，AChE活性及Aβ42、P-tau含量降低，且聯合組變化最明顯，DHA組次之，有氧運動組再次之，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；聯合組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

2.4各組小鼠海馬組織改良Bielschowsky神經染色液染色比較 光鏡下觀察，對照組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊，細胞內神經原纖維清晰、呈棕黑色、排列規(guī)則，可見伸入細胞突起；模型組海馬CA1區(qū)錐體細胞稍稀疏，核固縮，細胞內神經原纖維腫脹、深染、模糊，細胞外未見Aβ斑或老年斑和神經原纖維纏結；有氧運動組海馬CA1區(qū)錐體細胞稍增加，核固縮減少，神經原纖維腫脹減輕；DHA組海馬CA1區(qū)錐體細胞進一步增多，偶見核固縮，神經原纖維腫脹消除；聯合組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列有序，細胞內神經原纖維清晰，細胞外未見Aβ斑或老年斑和神經原纖維纏結。見圖1。

表3 各組小鼠海馬組織中ChAT、AChE活性和Aβ42、P-tau含量比較

圖1 各組小鼠海馬組織改良Bielschowsky神經染色液染色表現(×400)

3 討 論

隨著我國人口老齡化進程的加劇，AD嚴重危害著中老年人的身心健康，且已經突顯為社會的公共問題。其發(fā)病機制不明，尚無有效的治療藥物和治療技術，目前廣大學者更多地將注意力投入到探索輕度認知功能障礙干預途徑和機制上，試圖從源頭上早期防治AD[10]。

關于輕度認知功能障礙動物模型的建立，其應具有以下特征：①老年；②輕度學習記憶損害；③輕度膽堿能神經功能受損；④輕度APP/Aβ代謝紊亂但無老年斑，或輕度Tau蛋白異常磷酸化但無神經原纖維纏結；⑤輕度神經病理學改變。若出現4種及以上特征，即可判斷輕度認知功能障礙模型復制成功。目前常采用D-半乳糖和三氯化鋁造模，其中D-半乳糖是有機體內的一種還原性糖，老年小鼠腹腔注射后，在醛糖還原酶、半乳糖脫氫酶作用下，小鼠腦內產生大量活性氧自由基，導致氧化應激，引起神經元損傷[11-12]；小鼠灌服三氯化鋁，過量的鋁激活腦內小膠質細胞，誘發(fā)炎性應答，促進活性氧產生，導致神經元凋亡[13]。D-半乳糖和三氯化鋁聯合作用，共同引起小鼠腦神經損害和神經退行性變，從而出現衰老和學習記憶障礙等表現。本實驗結果顯示，老年小鼠腹腔注射D-半乳糖和灌服三氯化鋁4周后，小鼠出現逃避潛伏期延長,穿越原平臺位置次數減少,目標象限空間探索時間百分比降低,對立象限空間探索時間百分比提高，海馬組織中ChAT活性降低而AChE活性和Aβ42、P-tau含量升高，海馬CA1區(qū)錐體細胞稍稀疏、核固縮，細胞內神經原纖維腫脹、深染、模糊，細胞外未見Aβ斑或老年斑和神經原纖維纏結。這些結果符合輕度認知功能障礙動物模型的基本特征，說明模型復制成功。而模型組海馬組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低和MDA水平明顯升高，表明小鼠腦內發(fā)生了氧化應激。

諸多研究證明，有氧運動干預可以通過促進大腦血管神經再生，改善血液循環(huán)和神經連接，提升大腦的整體功能，改善認知功能[14-16]。米志寬等[9]研究提示有氧運動干預可增強衰老大鼠腦組織SOD、GSH-Px活性，降低MDA水平。仝楊楊[17]研究證實有氧運動可明顯減少AD小鼠腦內Aβ低聚物的含量。范佳等[8]研究表明有氧運動干預可提高衰老大鼠學習記憶能力。本實驗結果顯示，有氧運動組干預4周后，小鼠逃避潛伏期縮短,穿越原平臺位置次數增加,目標象限空間探索時間百分比提高,對立象限空間探索時間百分比降低，海馬組織中SOD、GSH-Px、ChAT活性升高，海馬組織中MDA水平、AChE活性及Aβ42、P-tau含量降低，與上述研究結果一致。

DHA為多不飽和脂肪酸，在哺乳動物體內不能合成，被稱為必需脂肪酸，其可通過血腦屏障，不僅參與大腦細胞膜的組成，影響細胞膜的流動性與完整性，而且對維持神經元信號轉導功能至關重要。趙秀娟等[18]研究結果提示DHA干預可提高老年癡呆大鼠腦組織SOD、GSH-Px活性，降低MDA水平，從而提高大鼠學習記憶能力。王霞等[19]研究報道，DHA可改善D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力。本實驗結果顯示，DHA組小鼠干預4周后逃避潛伏期縮短,穿越原平臺位置次數增加,目標象限空間探索時間百分比提高,對立象限空間探索時間百分比降低，海馬組織中SOD、GSH-Px、ChAT活性升高，海馬組織中MDA水平、AChE活性及Aβ42、P-tau含量降低，與上述研究相吻合。另外，聯合組干預4周后上述各指標亦明顯改善，且各指標變化均明顯優(yōu)于有氧運動組或DHA組，與對照組接近。表明有氧運動與DHA干預有一定協同性，可以基本逆轉輕度認知功能障礙小鼠的病理變化和認知障礙。

綜上所述，輕度認知功能障礙的發(fā)病因素、發(fā)病機制及病理變化比較復雜，大腦神經元丟失和突觸減少是一個長期、漸進、緩慢的過程，單一因素的改善，不足以對抗輕度認知功能障礙腦組織退行性變化及認識功能衰退的進程。DHA聯合有氧運動干預可以協同通過抑制氧化應激等機制明顯提高輕度認知功能障礙模型小鼠的學習記憶能力，為選用具有協同作用的復合方式、多靶點干預輕度認知功能障礙和防治AD提供了參考思路和實驗數據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。