周 用， 羅保平， 許 海

(1.湖北省中醫(yī)院腫瘤科， 湖北 武漢 430060 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)黃家湖醫(yī)院婦科， 湖北 武漢 430060)

腫瘤干細(xì)胞(cancerstem cell,CSC)是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根源，占總腫瘤細(xì)胞數(shù)的2%左右，對其進(jìn)行靶向清除可能是根治腫瘤的一種方法[1]。近年來，人們著眼于癌細(xì)胞的生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)的分子信號通路來探求宮頸癌的發(fā)生機(jī)制，尋找治療方法,取得了一系列的成果[2]。溶血磷酸酯(lysophosphatidic acid ，LPA)是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞間信號分子，可增加腫瘤惡性程度，亦能通過刺激 Akt磷酸化、激活 NF-κB等來抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，與子宮頸癌的生物學(xué)表達(dá)密切相關(guān)[3]。同時可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的遷移，與癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)[4]，RhoA作為在許多腫瘤中高表達(dá)的癌基因，在子宮頸癌中表達(dá)尤高[5]，并與其惡性表型相關(guān)，RhoA/Rock2信號通路在腫瘤細(xì)胞干性中發(fā)揮重要作用。已有研究證實，LPA激活RhoA/ROCK2信號通路對乳腺癌細(xì)胞的增殖有顯著促進(jìn)作用，而LPA是否經(jīng)由RhoA/ROCK2信號通路來完成子宮頸癌干細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性表達(dá)以及沉默RhoA基因能否抑制子宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性目前尚無定論[6]。本研究旨在探討LPA與RhoA/ROCK2信號通路之間的關(guān)系及二者在子宮頸癌干細(xì)胞中的調(diào)控作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器:Siha細(xì)胞株：購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑：購于美國Gibco公司，F(xiàn)ITC-anti-CD34、PE-cy5-anti-CD44、PE-anti-CD105：購于eBioscience公司，鼠抗人RhoA、ROCK2單克隆抗體：購于臺灣Abnova公司，ROCK特異性抑制劑Y-27632：購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶：購自Promega公司，Taq酶購自Fermentas公司，所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，熒光活化細(xì)胞分類儀：Beckman公司產(chǎn)品。

1.2子宮頸癌干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定:將Siha細(xì)胞接種于腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)液中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、胰島素、谷氨酰胺、B27以及青、鏈霉素)中進(jìn)行培養(yǎng)，收集懸浮的細(xì)胞球用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化形成單細(xì)胞懸液，以流式細(xì)胞術(shù)對培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行鑒定：收取培養(yǎng)后細(xì)胞離心10min，(1000rpm)，棄上清后重懸，分管，調(diào)適后每管細(xì)胞1×106，各管分別加入PE CD44+、PE CK17+、FITC CD34-，F(xiàn)ITC CD105-，4℃下避光孵育避光35min，繼以3mL PBS 洗滌2次，350u L PBS 重懸處理后的內(nèi)皮細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3LPA對子宮頸癌干細(xì)胞增殖能力的影響:將子宮頸癌干細(xì)胞接種于含小牛血清、青霉素與鏈霉素培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)為37℃、5% CO2，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代，再培養(yǎng)，將細(xì)胞接種于96孔板中，調(diào)節(jié)細(xì)胞個數(shù)為1×105個/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于24孔板，PBS溶液沖洗后，分加加入不同濃度的LPA(1、5、10、15、20umol/L)取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，抑制劑組以最佳促增殖濃度的LPA細(xì)胞組為基礎(chǔ)，加入Rho激酶抑制劑Y-27632，在24h、48h、72h、96h時對細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.4LPA對RhoA/Rock2的調(diào)控作用

1.4.1PCR法檢測各組細(xì)胞LPA、RhoA、Rock2的mRNA水平:采用TRIzol試劑提取三組細(xì)胞的RNA，取3ugRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行擴(kuò)增，采用熒光定量PCR試劑盒檢測各組細(xì)胞的LPA、RhoA、Rock2的mRNA表達(dá)量，擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4.2Western blot法檢測各組細(xì)胞RhoA及Rock2的表達(dá):按照《分子克隆實驗指南》的方法進(jìn)行Western blot檢測：在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入裂解液，提取總蛋白，常規(guī)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印和封閉，加入RhoA單抗與Rock2多抗，稀釋比例為1∶100，4℃過夜;加入稀釋比例為1∶5000的生物素標(biāo)記二抗，室溫下反應(yīng)2h，后取5μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Odyssey掃描儀攝片。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件對所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間計量資料比較采用F檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志性分子鑒定:經(jīng)過培養(yǎng)后，細(xì)胞均可見懸浮細(xì)胞球，原代細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化傳代后，均具有克隆能力，流式細(xì)胞術(shù)所得細(xì)胞各組陽性率分別為：CD44+：91.36%，CK17+：85.16%，CD34-：78.66%，CD105-：81.55%(圖1-4)。檢測結(jié)果顯示,宮頸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志性分子為CD44+、CK17+、CD34-、CD105-，細(xì)胞黏附分子CD44和子宮頸干細(xì)胞分子標(biāo)志物CK17為陽性,且CD34、CD105陰性，排除了其它細(xì)胞污染的可能性，結(jié)合觀察到的懸浮細(xì)胞球及細(xì)胞克隆，證實成功培養(yǎng)出了子宮頸癌干細(xì)胞。

2.2LPA對子宮頸癌干細(xì)胞增殖能力的影響:在培養(yǎng)第24h，不同濃度的LPA中子宮頸癌干細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05),自48h起，各組不同濃度LPA中細(xì)胞數(shù)量有顯著差異(P<0.05)，且濃度越高，時間越長，細(xì)胞數(shù)量越多(圖5)，證明LPA對子宮頸癌干細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，且呈劑量時間依賴關(guān)系。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)所得干細(xì)胞CD44+陽性表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)所得干細(xì)胞CK17+陽性表達(dá)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)所得干細(xì)胞CD34-陽性表達(dá)

圖4 流式細(xì)胞術(shù)所得干細(xì)胞CD105陽性表達(dá)

2.3RhoaA抑制劑Y-27632對子宮頸癌干細(xì)胞增殖能力的影響:將子宮頸癌干細(xì)胞，分為對照組、LPA組及抑制組，對照組正常培養(yǎng)，LPA組分別加入不同濃度的LPA，抑制劑組以含20umoL/L的LPA細(xì)胞組為基礎(chǔ)，加入10umoL/L的RhoA激酶抑制劑Y-27632，自48h起，抑制劑組細(xì)胞數(shù)顯著低于LPA組(P<0.05)，且時間越長，差異越明顯(P<0.05)，證明Y-27632對子宮頸癌干細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用(圖6).

圖5 不同濃度LPA下細(xì)胞生長曲線圖

圖6 Y-27632對子宮頸癌干細(xì)胞增殖能力的影響

2.4各組細(xì)胞LPA、RhoA、Rock2的mRNA水平:以對照組細(xì)胞的LPA、RhoA、Rock2的mRNA水平為對照組(1.0±0.00)，LPA組的LPA、RhoA、Rock2的mRNA水平較對照組均顯著升高(P<0.05),抑制劑組LPA的mRNA水平與LPA組無顯著差異(P>0.05),RhoA、Rock2的mRNA水平顯著低于LPA組，具體見表1。

表1 各組細(xì)胞LPA RhoA Rock2的mRNA水平

2.5各組細(xì)胞RhoA及Rock2蛋白的表達(dá):具體見表2，從結(jié)果中可以看出，LPA組的RhoA及Rock2蛋白表達(dá)量顯著高于對照組與抑制劑組(P<0.05)，抑制劑組的RhoA及Rock2蛋白表達(dá)量高于對照組(P<0.05)(圖7)。

圖7 各組細(xì)胞RhoA及Rock2蛋白的表達(dá)

表2 各組細(xì)胞RhoA及Rock2蛋白的表達(dá)

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞是由具有成瘤能力的CSC分化而來，雖然數(shù)量不多，但卻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等問題的根源[7]。在腫瘤的治療過程中，如果能針對CSC進(jìn)行靶向完全殺傷，即使不能縮小瘤體，也可以制約腫瘤細(xì)胞的生成，使瘤體痿縮，最終達(dá)到完全治愈的目的，本研究中,我們成功培養(yǎng)和收集了子宮頸癌干細(xì)胞,為進(jìn)一步的實驗打下了基礎(chǔ)。LPA是一種由血小板、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞分泌的小分子甘油磷酸脂,以多種形式存在于不同的組織/細(xì)胞中，LPA對干細(xì)胞有非常強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用，研究發(fā)現(xiàn)，LPA可使干細(xì)胞向機(jī)體發(fā)生損傷的部位遷移，同時刺激干細(xì)胞旁分泌作用，促進(jìn)傷口愈合[8]。而對于腫瘤干細(xì)胞上，則體現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的增殖與遷移。很早以前就有研究發(fā)現(xiàn)癌變組織中的LPA表達(dá)顯著升高，從而提出LPA可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[9]，之后的研究揭示LPA可通過各種途徑參與到腫瘤發(fā)生的病理過程，且直接影響到腫瘤惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移。LPA可以通過PLC的激活來增加Ca2+的流動,提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力，同時通過刺激Akt磷酸化、激活NF-κB抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]。目前已有的研究已證實LPA與卵巢癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞的增殖與遷移相關(guān)，也有諸多體外實驗研究證實LPA可以促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的生長增殖，且呈濃度時間依賴性，在臨床上，LPA也可以作為多種癌癥診斷或判斷預(yù)后的一項參考指標(biāo)[11]。在本研究中，我們對子宮頸癌干細(xì)胞采用了不同濃度的LPA進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后的癌細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，且呈劑量時間依賴關(guān)系，證實了LPA對子宮頸癌干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

LPA對腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)是多方面通路共同作用的結(jié)果，其中一條重要的信號通路為RhoA/Rock2信號通路，LPA可通過藕聯(lián)特定的G蛋白，LPAR1LPAR2、LPAR4和LPAR5結(jié)合,直接激活RhoA途徑，RhoA能夠影響多種分子的表達(dá),調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架，激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclearfactor kappa-B,NF-κB)等重要信號分子,影響細(xì)胞的增殖與遷移。同時研究發(fā)現(xiàn)，RhoA 的的ROCK2是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與遷移的主要參與者,在使用RhoA抑制劑Y-27632后，腫瘤細(xì)胞的樁蛋白的磷酸化水平也明顯減弱，研究發(fā)現(xiàn)，多種癌癥都存在RhoA/Rock2信號通路的異常表達(dá)，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[12]。韋紅衛(wèi)等人研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK2信號通路可能在宮頸癌浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定的作用。在本研究中，我們加入LPA后，發(fā)現(xiàn)可進(jìn)一步促進(jìn)子宮頸癌干細(xì)胞LPA的表達(dá)，宮頸癌干細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，且RhoA、Rock2的mRNA水平增加，RhoA、Rock2的蛋白表達(dá)量增加。加入RhoA抑制劑Y-27632后，LPA的mRNA表達(dá)量不變，但細(xì)胞增殖能力、RhoA、Rock2的mRNA水平及蛋白表達(dá)量顯著下降，說明RhoA/ROCK2信號通路與子宮頸頸癌有密切關(guān)系，而LPA對RhoA/ROCK2信號通路具有調(diào)控作用。

綜上所述，LPA可以促進(jìn)子宮頸癌干細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可以是通過調(diào)控RhoA/Rock2通路來實現(xiàn)的。在將來的進(jìn)一步研究中，我們將構(gòu)建沉默RhoA基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染宮頸癌干細(xì)胞，來探索RhoA/Rock2通路對子宮頸癌干細(xì)胞的影響，為將來靶向藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。