劉艷杰, 楊 陽

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科, 河南 鄭州 450000 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院婦科, 江蘇 南京 210006)

子宮內(nèi)膜異位癥是多發(fā)于育齡婦女的婦科疾病，特征為子宮內(nèi)膜組織(包括腺體、間質(zhì))異位種植到子宮腔被覆黏膜及子宮以外的部位，可引發(fā)疼痛、月經(jīng)失調(diào)、盆腔包塊，甚至不孕等癥狀或體征[1]。雖然子宮內(nèi)膜異位癥屬于良性疾病，但由于其具有種植廣泛、侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)等腫瘤類似生物學(xué)行為的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。目前，關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的學(xué)說研究較多，但其分子病理機(jī)制尚不完全明確，目前多認(rèn)為子宮內(nèi)膜增殖、遷移、黏附、侵襲是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過程的關(guān)鍵步驟[2]。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是具有蛋白與脂質(zhì)磷酸酯酶活性的抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等過程[3]。研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生與PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)[4]。榆梔止血顆粒是一種固經(jīng)止血、滋陰清熱的中成藥，成份復(fù)雜，常用來治療月經(jīng)過多、經(jīng)期延長(zhǎng)。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells，ESCs)是子宮內(nèi)膜的主要組成部分，本研究將通過研究榆梔止血顆粒含藥血清對(duì)異位ESCs細(xì)胞增殖、侵襲及PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，以期為榆梔止血顆粒用于治療子宮內(nèi)膜異位癥提供一定參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量250g左右，購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0012。

1.2試劑與儀器:胎牛血清(貨號(hào)：FBS500-S)購(gòu)自澳大利亞AusGeneX公司；榆梔止血顆粒(國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20130019)購(gòu)自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司；CCK-8試劑(貨號(hào)：CK-04)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；Matrigel基質(zhì)膠(貨號(hào)：356234)購(gòu)自美國(guó)BD公司；結(jié)晶紫(貨號(hào)：0528-100G)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：K1002S)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PTEN、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PTEN抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、GAPDH抗體(貨號(hào)：ab267787、ab8933、ab64148、ab181602)購(gòu)自abcam公司；PI3K抗體、p-PI3K抗體(貨號(hào)：bs-0128R-2、bs-5538R-2)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號(hào)：0295G-HRP)購(gòu)自美國(guó)santa公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購(gòu)自日本松下公司；酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)：MODEL550、ChemiDocXRS)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；顯微鏡(型號(hào)：CX31)購(gòu)自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀(ABI 7500)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1榆梔止血顆粒含藥血清的制備:24只SD大鼠隨機(jī)分為榆梔止血顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和空白對(duì)照組，每組6只，分別給予各組大鼠榆梔止血顆粒藥液(1g/mL、3g/mL、5g/mL)2.5mL及生理鹽水2.5mL灌胃，連續(xù)7d，末次給藥2h后，麻醉大鼠并通過腹主動(dòng)脈采血，37℃放置3h后，4℃靜置過夜，3000r/min離心15min，取上清液，0.22μm微孔濾膜除菌，將每組大鼠的血清混合，分為榆梔止血顆粒低、中、高劑量血清和空白血清。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2異位ESCs細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組:取異位子宮內(nèi)膜新鮮組織，無菌生理鹽水清洗，將組織剪成0.1～1mm3碎塊，加入含1%膠原酶和100μg/mL DNA酶的培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1～1.5h，用100目不銹鋼篩網(wǎng)過濾未消化組織，800r/min離心去上清，加入完全培養(yǎng)液將沉淀重懸為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí)，用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期異位ESCs細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，分別加空白血清、榆梔止血顆粒低劑量血清、榆梔止血顆粒中劑量血清和榆梔止血顆粒高劑量血清。

1.3.3CCK-8法檢測(cè)各組異位ESCs細(xì)胞增殖情況:將1.3.2中各組異位ESCs細(xì)胞培養(yǎng)48h，加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2h，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm處檢測(cè)各孔吸光度(optical density，OD)值。

1.3.4Transwell法檢測(cè)各組異位ESCs細(xì)胞侵襲情況:用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠(1：8)，向每個(gè)Transwell小室中加50μL，37℃ 1h凝固。用無血清培養(yǎng)液將1.3.2中各組異位ESCs細(xì)胞稀釋為2.5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以200μL接種于Transwell小室上層，下室中加入500μL 10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，擦去未侵襲細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定10min穿膜細(xì)胞，PBS洗滌，0.5%結(jié)晶紫染液染色20min。在顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)200倍鏡下的穿膜細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算平均值。

1.3.5qRT-PCR法檢測(cè)各組異位ESCs細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)情況:將1.3.2中各組異位ESCs細(xì)胞培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR法檢測(cè)PTEN mRNA表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10s，55℃退火35s，72℃延伸1min，循環(huán)40次。PTEN上游引物：5'-ACCAGAGA CAAAAAGGGAGTA-3'，下游引物：5'-ACCACAAACTGAGG ATTGCA-3'；GAPDH上游引物：5'-GAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：5'-GCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到臨界閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法表示。

1.3.6蛋白印跡(western blot，WB)法檢測(cè)各組異位ESCs細(xì)胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)情況:將1.3.2中各組異位ESCs細(xì)胞培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白并定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，分別加入PTEN抗體、p-PI3K抗體、PI3K抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1h，免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組異位ESCs細(xì)胞增殖情況:與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細(xì)胞OD值逐步遞減(P<0.05)，見表1。

表1 各組異位ESCs細(xì)胞OD值比較

2.2各組異位ESCs細(xì)胞侵襲情況:與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)逐步遞減(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 各組異位ESCs細(xì)胞侵襲情況(×200)

表2 各組異位ESCs細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.3各組異位ESCs細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)情況:與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)水平逐步遞增(P<0.05)，見表3。

表3 各組異位ESCs細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)水平比較

2.4各組異位ESCs細(xì)胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)情況:與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平逐步遞增(P<0.05)，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平逐步遞減(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 各組異位ESCs細(xì)胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)情況

表4 各組異位ESCs細(xì)胞中PTEN p-PI3K PI3K p-AKT AKT蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，是造成婦女盆腔痛、生育力低下、具有惡性腫瘤高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的重要原因，嚴(yán)重威脅育齡期婦女的健康[5]。近年來，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病有上升趨勢(shì)，發(fā)病率高達(dá)15%，進(jìn)行婦科手術(shù)的患者中被發(fā)現(xiàn)同時(shí)合并子宮內(nèi)膜異位癥的患者占5%～15%。現(xiàn)階段，臨床上通常將手術(shù)療法與藥物療法聯(lián)合用于子宮內(nèi)膜異位癥治療，以多種藥用植物為主的中藥療法或植物提取物在子宮內(nèi)膜異位癥中的治療應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注[6]。

榆梔止血顆粒主要由地榆炭、墨旱蓮、炒梔子組成，具有清熱、涼血、調(diào)經(jīng)止痛的功效，常用于治療血熱證所致月經(jīng)過多、經(jīng)期延長(zhǎng)等癥，可伴見口干心煩、尿赤便結(jié)、舌紅、苔黃、脈滑數(shù)等。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細(xì)胞OD值、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細(xì)胞OD值、侵襲細(xì)胞數(shù)逐步遞減，提示榆梔止血顆粒含藥血清可呈劑量依賴性抑制異位ESCs細(xì)胞的增殖與侵襲，可能在治療子宮內(nèi)膜異位癥中具有一定作用，但具體機(jī)制尚不清楚。

子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生與異位ESCs細(xì)胞的增殖、侵襲等密切相關(guān)，如何有效積極防治異位ESCs細(xì)胞的增殖、侵襲已成為預(yù)防子宮內(nèi)膜異位癥關(guān)鍵所在[7,8]。PTEN是一個(gè)抑癌基因，不僅參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展也有一定抑制作用。葉妮等[9]研究表明，PTEN的降低是EMs的發(fā)病機(jī)制之一，通過上調(diào)PTEN mRNA及蛋白表達(dá)可使異位內(nèi)膜出現(xiàn)凋亡性病理改變，而不影響在位內(nèi)膜的病理結(jié)構(gòu)。PI3K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，是人體內(nèi)基礎(chǔ)信號(hào)通路之一，參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、凋亡與侵襲等過程[10]。王靜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素可通過PI3K/Akt信號(hào)通路降低腹腔子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶體積。張亞萍等[12]研究亦發(fā)現(xiàn)，蠲痛飲治療子宮內(nèi)膜異位癥，抑制上皮間質(zhì)細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能是通過下調(diào)PI3K/Akt /mTOR通路蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用的。Zhang等[4]研究表明，miR-26a通過PTEN/PI3K/AKT途徑促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，隨著榆梔止血顆粒含藥血清的使用及劑量升高，異位ESCs細(xì)胞中PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示榆梔止血顆?？捎绊慞TEN/PI3K/AKT通路，可能通過促進(jìn)PTEN轉(zhuǎn)錄翻譯，抑制PI3K、AKT磷酸化蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制異位ESCs細(xì)胞的增殖與侵襲。

綜上所述，榆梔止血顆粒含藥血清可抑制異位ESCs細(xì)胞的增殖與侵襲，并影響PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，可能對(duì)治療子宮內(nèi)膜異位癥有一定幫助，但還需要進(jìn)一步深入研究。