景 明， 陳 瑜， 高 昕， 李繼影

（江蘇省蘇州環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇蘇州215000）

0 引 言

張家港位于江蘇省蘇州市，區(qū)域范圍內(nèi)水系發(fā)達(dá)，隨著區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人類活動(dòng)一定程度上影響了河道水質(zhì)。本研究主要針對(duì)張家港某生態(tài)污染河道河水呈赤紅色，經(jīng)顯微鏡初步鑒定發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象是由微生物爆發(fā)導(dǎo)致的生態(tài)污染事件。微生物是指示水生態(tài)環(huán)境變化的敏感指標(biāo)［1］。目前，微生物分類主要依靠光學(xué)根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征確定其種類［2］。但顯微鏡檢測(cè)適用于鑒定細(xì)胞體積較大，具有顯著形態(tài)學(xué)的大型細(xì)胞，對(duì)于部分個(gè)體較小的細(xì)胞無(wú)法有效鑒定［3］。

隨著基因測(cè)序技術(shù)不斷地發(fā)展與普及，大數(shù)據(jù)分析能力不斷提高，基因組研究手段正越來(lái)越多地應(yīng)用于鑒定形態(tài)學(xué)難以辨別的物種［4］。原核生物和真核生物的基因組都含有保守區(qū)和可變區(qū)，其中可變區(qū)能夠區(qū)分物種之間的差異，適用于進(jìn)行測(cè)序和分類鑒定，是研究環(huán)境樣品中微生物物種群落的重要手段。目前高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究藍(lán)藻水華的形成及其爆發(fā)原因的機(jī)理。本研究通過(guò)Illumina 測(cè)序?qū)υ摵拥赖脑松锛罢婧松锓謩e進(jìn)行測(cè)序，分析其群落結(jié)構(gòu)及成因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及前處理

本次采樣地點(diǎn)為張家港污染河道（坐標(biāo)為120°38′15.43E，31°48′32.11N），采樣時(shí)間2019-12-23，每個(gè)采樣點(diǎn)使用垂直采樣器在水面下0.5 m處收集5 L水樣，儲(chǔ)存在塑料瓶?jī)?nèi)，置于4 ℃冷藏箱后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在24 h內(nèi)完成水樣中微生物的富集。采用標(biāo)準(zhǔn)方法［5］測(cè)定以下常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)：葉綠素a、氨氮、總磷、總氮、化學(xué)需氧量、色度和pH。

樣品濃縮采用膜過(guò)濾法，將樣品通過(guò)醋酸纖維素濾膜（孔徑0.45 μm、直徑50 mm），用PBS（0.01 mol／L）對(duì)濾膜進(jìn)行洗脫。然后將洗脫液進(jìn)行高速離心濃縮（14 000 r／min，10 min），最后去掉上層清液，用1 mL PBS進(jìn)行洗脫，然后進(jìn)行DNA提取。

1.2 DNA提取及高通量測(cè)序

DNA提取采用CTAB［6］法標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，然后采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 濃度和純度檢測(cè)。最后取適量的樣本DNA于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng／μL作為基因組DNA 模板。根據(jù)待測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物（New England Biolabs 公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。本研究選擇針對(duì)原核生物16S rRNA基因中高度變化的V4 區(qū)域［7］以及真核生物18S rRNA的V4 區(qū)域［8］的引物作為擴(kuò)增子，詳見(jiàn)表1。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃5 min，94 ℃60 s，57 ℃45 s，72 ℃60 s，共34 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 終延伸10 min，16 ℃5 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度對(duì)樣品進(jìn)行等量混合，然后使用1 ×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，將剪切得到的目標(biāo)條帶使用試劑盒回收產(chǎn)物，試劑盒為T(mén)hermo Scientific 公司GeneJET 膠回收試劑盒。

使用建庫(kù)試劑盒（Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns，Thermofisher）進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（Ion S5TMXL，Thermofisher）。

表1 本研究PCR擴(kuò)增引物引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Cutadapt［9］先對(duì)原始數(shù)據(jù)的reads 進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切，去掉干擾數(shù)據(jù)，再根據(jù)Barcode 從處理后的數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行去除嵌合體序列處理，即對(duì)截去Barcode 和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)Reads 序列［10］通過(guò)與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列［11］，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean Reads）。

用Uparse 軟件［12］對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），選取OTUs 中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用RDP Classifier 方法與Silva132 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.6 ～1.0）。使用MUSCLE 軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs 序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后，以樣品中數(shù)據(jù)量最少為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha 多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析及多樣性指數(shù)

本次擴(kuò)增的第1 輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1 所示，所擴(kuò)增的基因片段條帶單一，長(zhǎng)度分別約為300 bp 及350 bp，真核生物的生物量顯著高于原核生物。

圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

測(cè)序共獲得16S rRNA 基因V4 可變區(qū)的88 968條原始序列，通過(guò)數(shù)據(jù)篩選后共得到80 148 個(gè)高質(zhì)量序列；18S rRNA 基因V4 可變區(qū)的88 510 條原始序列，通過(guò)數(shù)據(jù)篩選后，共得到87 841 個(gè)高質(zhì)量序列。

將序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，并通過(guò)對(duì)所抽到的序列數(shù)和代表的OTU數(shù)來(lái)構(gòu)建稀釋性曲線，如圖2 所示。由圖可知，原核生物得到的注釋為548 種OTU，真核生物得到的注釋為33 種，兩個(gè)樣品的稀釋曲線趨于平坦，說(shuō)明原核生物與真核生物的測(cè)序結(jié)果都較為完整，原核生物的物種分布較為均勻種群組成較為豐富；真核生物的種群組成比較單一。

圖2 OTUs稀釋曲線

對(duì)不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha Diversity 分析指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2（均一化時(shí)選取的數(shù)據(jù)量：cutoff ＝65 446（原核生物）；cutoff ＝79 939（真核生物））。Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)表示個(gè)體分布的均勻度，各物種之間個(gè)體分布越均勻，指數(shù)越高，如果每一個(gè)體都屬于不同的物種，指數(shù)則達(dá)到極值，由表可知真核生物的物種組成比原核生物單一。

表2 Alpha Indices 統(tǒng)計(jì)表

2.2 原核生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)樣品中的原核生物OTUs 進(jìn)行注釋后發(fā)現(xiàn)，本次樣品原核生物多樣性豐富，涵蓋了22 門(mén)74 種。其中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）21 種，占54.5%；擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）24 種，占15.77%；放線菌門(mén)（Actinobacteria）1 種，占12.37%：厚壁菌門(mén)（Firmicutes）15 種，占8.19%，如圖3 所示。原核生物OTUs前6 的屬占總測(cè)序量的百分比見(jiàn)表3，6 個(gè)屬OTUs總百分比僅為32.18%，表明原核生物種類分布較為均勻。

圖3 原核生物門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度餅狀圖

表3 原核生物主要物種注釋（前6 種）

2.3 真核生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)所得到真核生物的OTUs序列進(jìn)行物種注釋后發(fā)現(xiàn)，本次采集的樣品中真核生物種類比較單一，共發(fā)現(xiàn)4 個(gè)門(mén)12 種，其中金藻門(mén)（Chrysophyta）占93.95%，如圖4 所示，樣品中核心OTU 是Pedospumella encystans占93.94%，3 種微生物占真核生物的95%以上（見(jiàn)表4）。

圖4 真核生物門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度餅狀圖

表4 真核生物主要物種注釋（前3 種）

顯微鏡觀察結(jié)果如圖5 所示，藻體呈棒狀及螺旋狀，游動(dòng)速度較快。且棒狀藻體中含5 ～10 個(gè)顆粒狀色素體。幾乎所有的可見(jiàn)細(xì)胞均為該微生物，細(xì)胞顏色為紫紅色，水體中大量出現(xiàn)，導(dǎo)致河道水面呈現(xiàn)為紫紅色，形態(tài)學(xué)鑒定無(wú)法準(zhǔn)確判斷該微生物種類。

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果中真核生物和原核生物生物量以及物種豐度的區(qū)別，導(dǎo)致本次河道生態(tài)污染的微生物為Pedospumella encystans。篩選真核生物中特別關(guān)注的物種（相對(duì)豐度前10 的種）進(jìn)行物種分類樹(shù)統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行展示，其物種分類樹(shù)如圖6 所示。

圖5 顯微鏡觀察結(jié)果

圖6 樣本中特定物種分類樹(shù)

3 討 論

3.1 高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用

該河道微生物的優(yōu)勢(shì)種個(gè)體較小，通過(guò)顯微鏡難以準(zhǔn)確判斷其類別，而高通量測(cè)序技術(shù)具有能夠檢測(cè)數(shù)量較少、體積微小且不宜培養(yǎng)的微生物的能力［13］，用于檢測(cè)環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的生物多樣性［4］。目前江蘇省浮游藻類監(jiān)測(cè)主要建立在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)河道原核生物及真核生物的群落組成進(jìn)行研究，同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)引起本次河道生態(tài)污染的微生物為一種體積較小，難以通過(guò)傳統(tǒng)顯微鏡鑒定種類的真核浮游藻類。高通量測(cè)序技術(shù)可以彌補(bǔ)顯微鏡觀察中難以判斷的物種信息，從而提高了浮游藻類監(jiān)測(cè)的綜合能力［14］。

3.2 水環(huán)境因子對(duì)生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究中，河道的水質(zhì)參數(shù)如表5 所示。由表5可知，該河道水體屬于劣5 類水體，相比其他指標(biāo)化學(xué)需氧量濃度較低（5 類水40 mg／L），氨氮（5 類水2.0 mg／L）與總磷（5 類水0.4 mg／L）濃度較高，均超過(guò)5類水要求5 倍以上，可生化性較差（可生化處理的水質(zhì)推薦的碳氮比為100∶5，該河道碳氮比為1∶1，推測(cè)有工業(yè)廢水排入），對(duì)活性微生物繁殖造成影響，致使水體的自凈能力得到影響，當(dāng)有少數(shù)微生物能夠適應(yīng)該水質(zhì)條件時(shí)，該微生物易成為優(yōu)勢(shì)種。

表5 該河道水質(zhì)理化指標(biāo)

3.3 優(yōu)勢(shì)種Pedospumella encystans

金藻是生態(tài)學(xué)和生態(tài)生理學(xué)的原生模式種，一部分種類是水體中的初級(jí)生產(chǎn)力，另一部分是水體中部分細(xì)菌的捕食者，通常最佳生長(zhǎng)條件為溫度較低，透明度較好且有機(jī)物含量較低的水體［15］，在初春、晚秋或冬季多有發(fā)現(xiàn)，多數(shù)存活于水體的中下層，有研究表明在冰面下某些金藻種類仍能存活［16］。

近幾年，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和大系統(tǒng)分類學(xué)顯示了金藻門(mén)所包含種類的復(fù)雜性，許多種類為光合自養(yǎng)和異養(yǎng)生物之間的過(guò)渡［17］，其中異養(yǎng)型金藻與自養(yǎng)型金藻相比，具有較小的基因組和細(xì)胞體積，相對(duì)表面積較大，能夠高效利用環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)鹽且所需代謝時(shí)間短于其它藻類。Pedospumella encystans 屬于金藻綱（Chrysophyceae），色金藻目（Chromulinales），Chromulinales科，Pedospumella 屬，屬于一種異養(yǎng)型微型浮游藻類［15］，細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，僅含有一條鞭毛，Pedospumella encystans在中國(guó)發(fā)現(xiàn)較少，在已有研究中有報(bào)道，當(dāng)水質(zhì)的可生化性較差時(shí)，自養(yǎng)型微生物難以生存的條件下該種類易成為優(yōu)勢(shì)種［18］。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定能夠揭示水環(huán)境中微生物的多樣性及群落組成，得到更客觀、更準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)結(jié)果，在水生態(tài)監(jiān)測(cè)和水質(zhì)評(píng)價(jià)方面具有較好的應(yīng)用潛力。

（1）對(duì)張家港生態(tài)污染河道進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，群落組成單一，可見(jiàn)的微生物基本為同一種類。

（2）用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)18S rRNA 基因V4 區(qū)測(cè)序，結(jié)果顯示數(shù)量較多且群落組成單一，Pedospumella encystans 占93.94%。用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)16S rRNA 基因V4 區(qū)測(cè)序，結(jié)果顯示數(shù)量相對(duì)較少且群落分布較為均勻，由此得出主要的微生物為Pedospumella encystans。

（3）對(duì)該河道水質(zhì)進(jìn)行分析，推測(cè)該河道有工業(yè)廢水混入，可生化性較差，同時(shí)冬季河道水質(zhì)不利于常規(guī)藻類生長(zhǎng)，使得Pedospumella encystans 成為優(yōu)勢(shì)種，導(dǎo)致了本次河道生態(tài)污染事件。