焦偉偉

2019年，全球估算新發(fā)兒童結(jié)核病患者約120萬例，但實(shí)際上報(bào)例數(shù)不足50%，診斷困難是其主要影響因素[1]。對(duì)兒童結(jié)核病患者及時(shí)有效的診斷有助于早期干預(yù)治療，可明顯改善患兒預(yù)后。但與成年人相比，兒童咳嗽反射較弱，難以獲取合格的痰標(biāo)本；加之結(jié)核病患兒痰標(biāo)本細(xì)菌載量較低，病原學(xué)陽性檢出率低，極大地制約著臨床診斷工作的開展。近年來，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，新型結(jié)核病診斷方法不斷涌現(xiàn)，我國新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》也將分子生物學(xué)檢測納入到結(jié)核病的確診標(biāo)準(zhǔn)中，可見其對(duì)結(jié)核病的診斷具有重要應(yīng)用價(jià)值。筆者現(xiàn)針對(duì)這些新型診斷方法在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

一、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)

GeneXpert是以結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)的RNA聚合酶活性位點(diǎn)編碼區(qū)(81 bprpoB核心序列)為靶標(biāo)，采用半巢式實(shí)時(shí)半定量PCR進(jìn)行病原體檢測的方法。由于95%以上的利福平耐藥MTB菌株在rpoB核心區(qū)發(fā)生核苷酸變異，因此，該方法可同時(shí)檢測MTB對(duì)利福平的耐藥情況。

隨著GeneXpert在兒童人群中應(yīng)用研究的不斷增多，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)在2014年公布的數(shù)據(jù)顯示，在兒童肺結(jié)核診斷中，GeneXpert檢測咳出痰、誘導(dǎo)痰或胃液標(biāo)本的敏感度相近，均高于40%，特異度也較高，約為93%～100%；且對(duì)兒童痰液和胃液的檢測敏感度分別高于抗酸染色37%和44%，其中，對(duì)抗酸染色陽性患兒的檢測敏感度可達(dá)95%，對(duì)抗酸染色陰性患兒的檢測敏感度也達(dá)到55%～62%；以MTB培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測痰液和胃液的總敏感度和總特異度約為66%和98%[2]。同年，《兒童結(jié)核病管理指南(第2版)》[3]中對(duì)GeneXpert的臨床應(yīng)用也給出了較為明確的建議：對(duì)于臨床疑似肺結(jié)核患兒、耐多藥肺結(jié)核患兒，GeneXpert可先于抗酸染色或細(xì)菌培養(yǎng)作為初篩方法；病原學(xué)陽性結(jié)果對(duì)于疑似肺結(jié)核、耐多藥肺結(jié)核、肺結(jié)核并發(fā)HIV感染、肺結(jié)核與其他疾病鑒別診斷，以及復(fù)治肺結(jié)核患兒的診斷具有重要價(jià)值。這說明GeneXpert對(duì)兒童結(jié)核病的診斷具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，2015年的一項(xiàng)薈萃分析指出，盡管GeneXpert檢測培養(yǎng)陽性結(jié)核病患兒痰標(biāo)本具有較好的敏感度，但檢測培養(yǎng)陰性患兒痰標(biāo)本的敏感度僅為2%[4]。這提示對(duì)兒童結(jié)核病的診斷亟需更加敏感的檢測方法。

二、超敏結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥基因檢測方法(GeneXpert MTB/RIF Ultra)

2017年3月24日第22個(gè)世界防治結(jié)核病日，WHO推薦了新一代GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測技術(shù)[5]。相對(duì)于GeneXpert技術(shù)，該方法新增了IS6110和IS1081多拷貝序列分子靶標(biāo)，擴(kuò)大了DNA擴(kuò)增體積(由GeneXpert的25 μl 體系增加至50 μl體系)，并采用全巢式PCR擴(kuò)增、更加快速的熱循環(huán)、改良的流體力學(xué)和酶，明顯提高了檢測敏感度，檢出限可達(dá)16 CFU/ml(GeneXpert的檢測限為114 CFU/ml)；對(duì)檢測MTB菌量較少的標(biāo)本具有更優(yōu)越的性能，尤其是涂陰標(biāo)本和兒童結(jié)核病標(biāo)本。

一項(xiàng)評(píng)估GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測兒童肺結(jié)核效能的多中心研究結(jié)果顯示，GeneXpert MTB/RIF Ultra和GeneXpert對(duì)兒童第1份痰標(biāo)本檢測的敏感度分別為64.3%和53.6%，特異度分別為98.1%和100.0%[6]。而我國采用該技術(shù)進(jìn)行兒童結(jié)核病的多中心研究結(jié)果顯示，GeneXpert MTB/RIF Ultra對(duì)結(jié)核病患兒支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本檢測的敏感度和特異度分別為70%和98%，且敏感度高于GeneXpert約13%；同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)陽性和陰性患兒的檢測敏感度分別為91%和58%[7]。在對(duì)胃液標(biāo)本進(jìn)行檢測時(shí)，GeneXpert MTB/RIF Ultra對(duì)所有結(jié)核病患兒、病原學(xué)陽性患兒和臨床診斷患兒檢測的敏感度分別為60.5%、87.5%和44.4%；且對(duì)4歲以下患兒胃液標(biāo)本的檢出率更高(80.0%)[8]。因此，WHO推薦的適用于GeneXpert檢測的臨床應(yīng)用范圍也適用于GeneXpert MTB/RIF Ultra，可用于初始診斷具有結(jié)核病癥狀的患兒。

此外，考慮到兒童標(biāo)本獲取的便捷性，有學(xué)者把目光轉(zhuǎn)向了更易獲取的標(biāo)本，如糞便、鼻咽吸取物和尿液。來自孟加拉國的一項(xiàng)納入447例患兒的研究表明，以痰標(biāo)本細(xì)菌學(xué)陽性為參考標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測糞便標(biāo)本的敏感度和特異度分別為58.6%和89.7%，而GeneXpert分別為37.9%和100.0%[9]。我國上海的一項(xiàng)研究也取得了相似的結(jié)果，即以臨床綜合診斷結(jié)果作為參考，GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測呼吸道和糞便標(biāo)本的敏感度分別為52.0%和45.5%[10]。另一項(xiàng)對(duì)195例南非患兒鼻咽吸取物和誘導(dǎo)痰標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測1份鼻咽吸取物和1份誘導(dǎo)痰標(biāo)本的敏感度為46.0%和74.3%，而同時(shí)檢測這2份標(biāo)本的敏感度可達(dá)80%；若同時(shí)檢測2份鼻咽吸取物，則敏感度為54.2%，而同時(shí)檢測2份鼻咽吸取物和1份誘導(dǎo)痰標(biāo)本，則敏感度高達(dá)87.5%[11]。由此可見，盡可能檢測多份同一類型或同時(shí)檢測不同類型標(biāo)本可提高該方法對(duì)兒童結(jié)核病的診斷效率。需要注意的是，檢測尿液標(biāo)本對(duì)泌尿系結(jié)核患兒的診斷具有一定的價(jià)值，但對(duì)肺結(jié)核患兒的診斷沒有幫助[12-13]。

三、基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)核病診斷方法

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的新型體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有快速、高效、特異的優(yōu)點(diǎn)，且無需專用設(shè)備。目前已發(fā)展出較多基于該技術(shù)的結(jié)核病診斷方法，主要有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重組酶聚合酶擴(kuò)增 (recombinase polymerase amplification，RPA)、多交叉置換恒溫?cái)U(kuò)增(multiple cross displacement amplification, MCDA)等。但相關(guān)技術(shù)在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究較少，需進(jìn)一步評(píng)估其臨床價(jià)值。

2016年，WHO發(fā)布了《TB-LAMP在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用》[14]，對(duì)全球7個(gè)國家5年內(nèi)的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行了總結(jié)和評(píng)估，建議在診斷疑似肺結(jié)核患者時(shí)，TB-LAMP技術(shù)可替代或作為痰涂片鏡檢的補(bǔ)充方法，尤其是痰涂片鏡檢陰性時(shí)。隨后的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，以培養(yǎng)結(jié)果為參照，TB-LAMP檢測結(jié)核病的匯總敏感度和特異度分別為77.7%和98.1%，其中，檢測涂片陰性患者的匯總敏感度為42.1%[15]，提示在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)地區(qū)TB-LAMP具有較好的診斷能力。但TB-LAMP的檢測結(jié)果多是依靠肉眼進(jìn)行濁度或熒光亮度的判斷，存在一定的主觀性。為避免這一缺陷，Ai等[16]建立了基于RPA結(jié)合成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)的結(jié)核病快速檢測方法。該方法依靠gRNA特異性識(shí)別靶序列后經(jīng)Cas12a剪切產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行檢測，達(dá)到了幾乎單拷貝的敏感度，且所需樣本量少。采用成年人結(jié)核病臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)采用CRISPR-MTB對(duì)總體患者進(jìn)行檢測的敏感度(79%)高于培養(yǎng)(33%)和GeneXpert(66%)，特異度高達(dá)98%；而對(duì)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本和結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測時(shí)，CRISPR-MTB、GeneXpert和培養(yǎng)的敏感度分別為90%、75%、41%和73%、54%、23%；但對(duì)其他肺外結(jié)核標(biāo)本檢測時(shí)，CRISPR-MTB與GeneXpert的敏感度相近，在軟組織膿液標(biāo)本中達(dá)到100%，在尿液和漿膜腔液標(biāo)本中達(dá)到55%。這提示隨著檢測技術(shù)敏感度的提高，膿液標(biāo)本的檢出率得到了極大的提升。

筆者建立了一種基于MCDA的MTB檢測方法，該方法以多拷貝序列(IS6110和IS1081)為雙靶標(biāo)，除了具備TB-LAMP 的優(yōu)勢外，還提升了檢測的敏感度和反應(yīng)速度。研究中采用基于納米顆粒的橫向流動(dòng)生物傳感器進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：MCDA對(duì)所有結(jié)核病患者檢測的敏感度為88.2%，高于液體培養(yǎng)(42.0%)和GeneXpert(49.6%)；尤其對(duì)培養(yǎng)陰性標(biāo)本檢測的敏感度高達(dá)81.2%，遠(yuǎn)高于GeneXpert(23.2%)，顯示出較好的臨床應(yīng)用前景[17]。

四、宏基因組測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和普及，其在臨床微生物檢測領(lǐng)域中也發(fā)揮了重要作用。mNGS是其最常用的方法，是直接對(duì)提取自臨床標(biāo)本的全部微生物核酸進(jìn)行無差別和無選擇性的大規(guī)模測序，再將序列信息與已知微生物數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，從而判斷樣本中微生物的種類和含量。mNGS對(duì)培養(yǎng)困難的病原體(如MTB)具有明顯優(yōu)勢。已有報(bào)道顯示，mNGS在肺結(jié)核(痰和灌洗液標(biāo)本)和肺外結(jié)核(腦脊液和膿液標(biāo)本等)的診斷中均具有較高的敏感度[18-21]。上海市肺科醫(yī)院的一項(xiàng)研究評(píng)估了mNGS在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應(yīng)用價(jià)值，研究共納入45例結(jié)核性腦膜炎患者和6例對(duì)照患者，以最終臨床診斷為參考，mNGS的檢測敏感度為84.44%，高于液體培養(yǎng)(22.2%)和GeneXpert(40%)[21]，且特異度為100.00%，提示mNGS可明顯提升結(jié)核性腦膜炎患者的病原學(xué)確診率，具有較好的應(yīng)用前景。Zhao等[20]采用mNGS檢測骨關(guān)節(jié)感染患者的膿腫標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)mNGS不僅可檢出全部的骨結(jié)核患者，還可以在治療失敗的患者中檢測到MTB與其他病原體的混合感染，對(duì)于臨床治療具有指導(dǎo)意義。目前，mNGS研究中雖然納入了部分兒童患者，但尚未有大樣本量且針對(duì)兒童不同類型標(biāo)本的應(yīng)用評(píng)估，需進(jìn)一步研究。

五、宿主基因表達(dá)譜

近年來，基于宿主的結(jié)核病診斷方法也越來越受到關(guān)注，研究較多的是MTB感染后機(jī)體基因表達(dá)水平的變化，其中多數(shù)與結(jié)核病預(yù)測、診斷和療效監(jiān)測的基因組合相關(guān)。Zak等[22]在南非和岡比亞青少年(12～18歲)MTB感染隊(duì)列中定期監(jiān)測了全血RNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)了可預(yù)測活動(dòng)性結(jié)核病的16個(gè)基因組合，敏感度和特異度分別為66.1%和80.6%。Anderson等[23]分析了來自非洲的2955例疑似結(jié)核病患兒全血中的mRNA表達(dá)水平，明確了與結(jié)核病患兒相關(guān)的51個(gè)mRNA表達(dá)改變，并以此建立了一個(gè)診斷評(píng)分系統(tǒng)；該評(píng)分系統(tǒng)診斷結(jié)核病的敏感度和特異度分別為82.9%和83.6%，而GeneXpert檢測的敏感度為54.3%。Sweeney等[24]利用公共基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)庫，比較了結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(LTBI)者或其他疾病者與活動(dòng)性結(jié)核病患者的基因表達(dá)差異，建立了基于3個(gè)基因(GBP5、DUSP3和KLF2)表達(dá)水平的診斷體系，并在10個(gè)國家的兒童和成年人數(shù)據(jù)中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示該診斷體系區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病與健康對(duì)照者、LTBI者和其他疾病者的受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)分別為0.90、0.88和0.84；并證明了這3個(gè)基因的表達(dá)不受HIV感染、細(xì)菌耐藥性或卡介苗接種的影響；且在活動(dòng)性結(jié)核病患者治療期間，基于這3個(gè)基因的總評(píng)分會(huì)下降，提示該體系不僅對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病具有很好的診斷價(jià)值，也對(duì)治療監(jiān)測方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。盡管宿主基因表達(dá)模型在結(jié)核病預(yù)測、診斷和治療監(jiān)測方面表現(xiàn)出了良好的敏感度和特異度，但也有學(xué)者指出宿主的基因表達(dá)水平與其性別、年齡和MTB感染狀態(tài)等因素密切相關(guān)[25]，需進(jìn)一步細(xì)化研究以尋找適合兒童結(jié)核病診斷的最佳基因組合。

六、 問題與不足

由于目前不同的研究中采用不同的診斷方法，檢測的敏感度差異較大，同時(shí)也缺乏采用多種分子診斷技術(shù)對(duì)同一批標(biāo)本進(jìn)行檢測的大型研究，使得各種檢測方法不具備可比性。另外，文中涉及的方法均是近年來比較新的技術(shù)，除GeneXpert外，大多尚處于研究階段，臨床可及性并不好，難以比較各方法檢測的實(shí)用性或陽性率高低的意義。又由于結(jié)核病患兒標(biāo)本采集比較困難，使得新型診斷方法一般先通過成年人的研究驗(yàn)證后，方可推廣到兒童患者中，如文中基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)核病診斷方法和mNGS測序技術(shù)等雖在成年人結(jié)核病診斷中顯示了良好的應(yīng)用前景，但缺乏在兒童樣本中的研究數(shù)據(jù)，尚需要進(jìn)一步研究來驗(yàn)證其相關(guān)診斷效能。

綜上，分子生物學(xué)診斷技術(shù)極大地提高了兒童結(jié)核病的檢出效率。敏感度高、特異度強(qiáng)、快速、經(jīng)濟(jì)、便捷，以及標(biāo)本類型易采集且可多次重復(fù)檢測的分子診斷方法，是兒童患者亟需的最佳診斷方法。臨床醫(yī)生可根據(jù)不同診斷方法的可及性、特點(diǎn)及價(jià)格等方面進(jìn)行綜合選擇，以有效發(fā)揮其在兒童結(jié)核病診斷中的價(jià)值。