桂徐蔚 柯薈 顧瑾

2017年全球新發(fā)結(jié)核病患者630萬例，16%為肺外結(jié)核，其中結(jié)核性胸膜炎為成人肺外結(jié)核最常見的類型[1]。美國結(jié)核性胸膜炎占所有結(jié)核病患者的3.7%[2]，巴西占8.7%[3]，中國占6.5%～8.7%[4-5]，西班牙占10%～19.3%[6-8]，非洲國家可超過20%[9-10]。印度30%～80%的胸腔積液為結(jié)核性胸膜炎[11]。在結(jié)核病流行率高的國家，結(jié)核性胸膜炎是胸腔積液的主要原因。

目前結(jié)核性胸膜炎的診斷金標準仍然是菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌，但胸腔積液中難以檢測出結(jié)核分枝桿菌，有時甚至需要手術(shù)獲取胸膜組織進行組織學、微生物學或分子檢查，因此臨床需要結(jié)合細菌學、病理學、分子生物學、細胞免疫學及綜合性診斷策略來實現(xiàn)，且與惡性胸膜疾病及其他感染性胸膜疾病鑒別診斷困難。近年來，針對結(jié)核性胸腔積液生物標志物的研究眾多，核酸檢測技術(shù)的進步及在結(jié)核病領域的廣泛應用也為結(jié)核性胸膜炎提供了新的診斷方法。雖然目前尚無單一有效的確診生物標志物，但多種方法的聯(lián)合應用可極大提高診斷的準確性[12]。

一、免疫學診斷方法

眾所周知，胸膜腔內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌可激活CD4+T淋巴細胞，并觸發(fā)延遲超敏反應。免疫反應由γ干擾素(IFN-γ)等介導，反饋機制涉及其他細胞因子如白細胞介素(IL)等。在結(jié)核病中、高發(fā)病率地區(qū)，腺苷脫氨酶(ADA)、IFN-γ和IL-27有助于臨床表現(xiàn)符合疑似結(jié)核性胸腔積液患者的診斷。

1. ADA：ADA是一種參與嘌呤代謝的酶，存在于多種類型的細胞中，尤其是活化的T細胞，在T淋巴細胞的分化中發(fā)揮重要作用。自1978年P(guān)iras首次報道結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液ADA升高以來[13]，與其相關(guān)的研究一直是熱點所在。

胸腔積液ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度和特異度分別為88%～100%和81%～97%，在HIV感染者中亦有相似的診斷率[14-15]。目前已知存在ADA1和ADA2兩種同工酶，ADA1在淋巴細胞和單核細胞中活性較高，ADA2則主要在單核細胞和巨噬細胞中。在結(jié)核性胸膜炎中，ADA2同工酶占總ADA活性的88%。因此，ADA1/總ADA<0.42的準確性優(yōu)于總ADA，其敏感度為100%，特異度為97%～99%[16]。一項納入387例結(jié)核性胸膜炎患者的研究結(jié)果顯示，與總ADA(臨界值：52.4 U/L)相比，ADA2(臨界值：40.6 U/L)的診斷性能更優(yōu)，敏感度和特異度分別為97.2%和94.2%，而總ADA的診斷敏感度和特異度分別為93.7%和88.7%[17]。研究顯示，總ADA值低于40 U/L時，診斷結(jié)核性胸膜炎有極好的陰性預測值(negative predictive value，NPV)，當總ADA值高于70 U/L時，診斷結(jié)核性胸膜炎有極好的陽性預測值(positive predictive value，PPV)。然而，在結(jié)核病低流行地區(qū)，PPV可低至15%。當結(jié)核病的預測概率在10%、20%、30%時，估計PPV分別為66%、81%、88.5%，NPV為95.6%～98.8%[18]。

其他疾病也可能導致胸腔積液ADA增高，最常見的是并發(fā)于肺炎的胸腔積液 (1/3的患者ADA會增高)和膿胸(2/3的患者ADA會增高)；另外淋巴瘤、實體瘤、結(jié)締組織疾病(主要是類風濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡)和布魯桿菌病、昆士蘭蜱傳斑疹傷寒、組織胞漿菌病和球孢子菌病亦有ADA增高的報道[19]。胸腔積液ADA增加的患者中，若胸腔積液細胞分類以淋巴細胞為主，主要與非霍奇金淋巴瘤鑒別；若胸腔積液細胞分類以中性粒細胞為主，可評估乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)/ADA的比率，與并發(fā)于肺炎的胸腔積液進行鑒別，其LDH/ADA比率較結(jié)核性胸膜炎升高10倍以上[20]。

綜上所述，ADA是一種用于結(jié)核性胸膜炎診斷的高敏感度及特異度的生物標志物，特別是在結(jié)核病中高發(fā)病率地區(qū)。盡管ADA2具有優(yōu)越的性能，但在臨床實踐中，仍推薦應用胸腔積液總ADA值，因其敏感度高、成本低，并可在數(shù)小時內(nèi)獲得結(jié)果，這對我國基層實驗室的廣泛開展尤為重要。

2. IFN-γ：IFN-γ是一種由CD4+T淋巴細胞激活后釋放的細胞因子，能增加巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌的殺菌活性，是一種高效的診斷結(jié)核性胸膜炎的生物標志物。

為了評估IFN-γ在胸腔積液診斷中的敏感度、特異度和其他準確性指標，Jiang等[21]納入了22項研究并進行薈萃分析，結(jié)果顯示：IFN-γ的敏感度為89% (95%CI：87%～91%)；特異度為97% (95%CI：96%～98%)；陽性似然比為23.45 (95%CI：17.31～31.78)；陰性似然比為0.11 (95%CI：0.07～0.16)；診斷優(yōu)勢比為272.7 (95%CI：147.5～504.2)。Greco等[22]進行了一項薈萃分析，納入了31個ADA的臨床研究(4738例患者)及13個IFN-γ的臨床研究(1189例患者)。受試者工作特征曲線顯示，ADA和IFN-γ的最大聯(lián)合敏感度和特異度分別為93%和96%。在結(jié)核性胸膜炎患病率為5%、25%和85%的情況下，ADA陰性的驗后概率分別為0.4%、2.4%和24%，IFN-γ陰性的驗后概率分別為0.22%、1.2%和17%。因此，這兩種生物標志物在診斷結(jié)核性胸膜炎方面都是非常準確的。

雖然IFN-γ特異度更高，但在惡性腫瘤和膿胸患者中亦可能升高；此外，高成本、量化技術(shù)、臨界值不確定是限制其在實驗室應用的重要因素。

3.γ干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay，IGRA)：IGRA是通過結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激T淋巴細胞釋放IFN-γ來檢測是否為結(jié)核分枝桿菌感染的檢查方法。陽性表明既往感染過結(jié)核分枝桿菌。與PPD相比，IGRA檢測陽性可排除卡介苗接種及大部分非結(jié)核分枝桿菌感染[23]。

然而，胸腔積液IGRA檢測對結(jié)核性胸膜炎的診斷效能是有爭議的。為了評估血液和胸腔積液IGRA檢測對結(jié)核性胸腔積液的診斷效能，Aggarwal等[24]進行了薈萃分析，納入19項研究，血液和胸腔積液檢測分別涉及1085例和727例受試者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：血液IGRA檢測的敏感度和特異度分別為77% (95%CI：71%～83%)和71% (95%CI：65%～76%)；胸腔積液IGRA檢測的敏感度和特異度分別為72%(95%CI：55%～84%)和78%(95%CI：65%～87%)。由此得出結(jié)論：基于血液和胸腔積液的IGRA檢測對疑似結(jié)核性胸腔積液患者的診斷準確性較差。Pang等[25]對15項研究進行了薈萃分析，評估IGRA對結(jié)核性胸腔積液診斷的準確性指標。結(jié)果顯示：結(jié)核性胸腔積液患者中，血液IGRA檢測的敏感度和特異度分別為80%(95%CI：76%～83%)和70%(95%CI：65%～75%)；陽性似然比為2.48 (95%CI：1.95～3.17)；陰性似然比為0.30 (95%CI：0.24～0.37)；PPV為0.79 (95%CI：0.60～0.87)；NPV為0.75 (95%CI：0.62～0.83)；診斷優(yōu)勢比為9.96 (95%CI：6.02～16.48)；受試者工作特征曲線下面積(area under curve，AUC)為0.89。胸腔積液IGRA檢測的敏感度和特異度分別為82%(95%CI：79%～85%)和87% (95%CI：84%～90%)；陽性似然比為4.94 (95%CI：2.60～9.39)；陰性似然比為0.22 (95%CI：0.13～0.38)；PPV為0.91 (95%CI：0.85～0.96)；NPV為0.79 (95%CI：0.71～0.85)；診斷優(yōu)勢比為28.37 (95%CI：10.53～76.40)；AUC為0.91。可見，胸腔積液IGRA是一種潛在的輔助診斷方法，但高成本和中效能限制了其在實驗室的廣泛應用。

雖然胸腔積液IGRA較血液的診斷效能更好，但IGRA檢測用于結(jié)核性胸膜炎的診斷仍有爭議。研究結(jié)果的異質(zhì)性可能與結(jié)核病流行情況和IGRA診斷結(jié)核性胸膜炎的臨界值標準不同有關(guān)。

4. 其他生物標志物：結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液中有眾多生物因子水平增高， IL-27是經(jīng)證實的診斷效能較高的生物標志物，其他生物因子如IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-2可溶性受體(soluble receptor of interleukin-2，sIL-2Rs)、IL-18、免疫抑制酸蛋白(immunosuppressive acid protein，IAP)和白細胞介素-12p40亞基(interleukin-12 p40 subunit，IL-12p40)、溶菌酶水平亦增高，但它們的診斷特異度較低，臨床相關(guān)性及診斷效能仍需要進一步確定[26]。

IL-27是白細胞介素-12家族的成員，通過T輔助1型反應參與IFN-γ的產(chǎn)生。許多研究，包括一些薈萃分析，均報告了IL-27對結(jié)核性胸膜炎診斷的有效性[27-30]。在Liu等[28]的薈萃分析中總結(jié)了IL-27在區(qū)分結(jié)核性胸腔積液與惡性胸腔積液(兩者胸腔積液的細胞分類均以淋巴細胞為主)方面的出色表現(xiàn)。共納入7項病例對照研究，共550例患者(285例結(jié)核性胸腔積液患者和265例惡性胸腔積液患者)。IL-27在診斷結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的綜合評價分別為：敏感度93% (95%CI：90%～96%)、特異度97% (95%CI：94%～98%)、陽性似然比25.88 (95%CI：13.84～48.39)、陰性似然比0.07 (95%CI：0.05～0.11)、優(yōu)勢比333.26 (95%CI：146.10～760.19)，AUC為0.99。由此得出結(jié)論：IL-27在結(jié)核性胸膜炎的診斷中具有較高的敏感度、特異度和準確性。我國Wu等[29]的研究比較了IL-27、IFN-γ和(或)ADA聯(lián)合用于鑒別結(jié)核性胸膜炎和其他病因胸腔積液的診斷準確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這3種生物標志物的聯(lián)合使用可使診斷的敏感度或特異度提高至100%。由此得出結(jié)論，IL-27是診斷結(jié)核性胸膜炎最有效的生物標志物，IL-27單獨或聯(lián)合IFN-γ和ADA可能是臨床診斷結(jié)核性胸膜炎的優(yōu)選策略。李芳等[30]的研究納入因胸腔積液就診的88例患者，其中結(jié)核性胸腔積液44例、惡性胸腔積液20例、炎性胸腔積液12例和漏出性胸腔積液12例。檢測各類患者胸腔積液中IL-27、IFN-γ和ADA的水平，繪制受試者工作特征曲線，根據(jù)敏感度、特異度和準確度等指標評價其對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-27和IFN-γ水平明顯高于其他三組(P<0.05)。胸腔積液中IL-27、IFN-γ和ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度分別為100.0%、61.4%和78.6%；特異度分別為94.4%、89.5%和92.1%； AUC分別為0.96、0.79和0.92；IL-27、IFN-γ和ADA三者聯(lián)合檢測時，特異度(97.4%)高于單獨檢測。由此得出結(jié)論：胸腔積液IL-27對結(jié)核性胸膜炎診斷價值高于IFN-γ和ADA，三者聯(lián)合可以提高檢測的特異度。

總之，在結(jié)核性胸膜炎的診斷中，IL-27是一種潛在的有效生物標志物，與其他生物標志物聯(lián)合使用時，診斷的敏感度或特異度可進一步提高。

二、分子生物學診斷方法

近年來分子檢測技術(shù)取得了飛躍的進步，核酸擴增試驗(NAATs)和GeneXpert MTB/RIF的優(yōu)勢明顯，已廣泛應用于結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的準確、快速診斷。結(jié)核性胸膜炎的胸腔積液分子檢測特異度高，但敏感度有限，診斷性能尚有欠缺。

1. NAATs：診斷結(jié)核性胸膜炎的金標準為結(jié)核分枝桿菌陽性，但由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，且陽性率低，導致診斷延誤。NAATs可用于胸腔積液或胸膜組織等臨床標本的結(jié)核分枝桿菌基因快速檢測。僅需結(jié)核分枝桿菌達到102CFU/ml，結(jié)果可以在數(shù)小時內(nèi)獲得，且不受患者的免疫功能影響[31]。NAATs中使用的靶基因有IS6110、GCRS、MPB-64、devR或CD192等，它們具有不同的敏感度和特異度。研究表明，結(jié)核分枝桿菌基因組的DNA序列檢測具有更好的診斷性能。

NAATs的敏感度仍取決于胸腔積液結(jié)核分枝桿菌的鏡檢和培養(yǎng)結(jié)果。Moon等[32]報道，當胸腔積液結(jié)核分枝桿菌鏡檢陰性及培養(yǎng)陽性時，敏感度為33%；當兩者均為陰性，僅胸膜活檢為陽性時，敏感度僅為3.7%。NAATs的敏感度低主要是因為胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌數(shù)量較少，也可能與胸腔積液中存在的固有抑制劑及結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)隔離有關(guān)，這些均阻礙了DNA的提取和擴增[31]。

GeneXpert MTB/RIF為目前臨床應用較為廣泛的核酸擴增檢測方法。GeneXpert MTB/RIF是一種快速、自動化的分子檢測方法，痰結(jié)核分枝桿菌涂片陽性患者的敏感度和特異度較高，均為98%，但痰結(jié)核分枝桿菌涂片陰性患者的敏感度和特異度較低，分別為67%和99%[33]。GeneXpert MTB/RIF診斷結(jié)核性胸膜炎的結(jié)果不盡如人意。

Penz等[34]和Sehgal等[35]的2個薈萃分析研究顯示，GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度為37%～51.4%，特異度較高，可達99%。這些薈萃分析將GeneXpert MTB/RIF結(jié)果與微生物標準或其他參照標準進行對比，評估了GeneXpert MTB/RIF的性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或PCR陽性的情況下，GeneXpert MTB/RIF可獲得最佳的敏感度結(jié)果。Meldau等[36]進行了一項前瞻性隊列研究，納入93例胸腔積液患者，包括40例確診的結(jié)核病患者，5例結(jié)核可能患者和48例非結(jié)核病患者。研究評估了胸腔積液結(jié)核分枝桿菌鏡檢、ADA、IFN-γ和GeneXpert MTB/RIF的診斷效能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IFN-γ的敏感度最高，為92.5%，ADA的敏感度中等，為55.3%～79.0%，GeneXpert MTB/RIF的敏感度最低，為22.5%，且樣品離心并沒有提高GeneXpert MTB/RIF的檢測敏感度。3種診斷方法特異度均較高，可達92.0%。由此得出結(jié)論：GeneXpert MTB/RIF檢測對診斷結(jié)核性胸膜炎的價值有限，而IFN-γ是一個很好的診斷和排除結(jié)核性胸膜炎的生物標志物。

Kohli等[37]對Cochrane數(shù)據(jù)庫最近的研究進行了薈萃分析，旨在確定GeneXpert MTB/RIF對肺外結(jié)核的診斷準確性，并評估肺外結(jié)核患者對利福平的耐藥性。研究共納入66項研究，對16 213份肺外標本進行了GeneXpert MTB/RIF檢測。與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性者比較，結(jié)核性胸膜炎患者GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度和特異度分別為50.9%(39.7%～62.8%)和99.2% (98.2%～99.7%)。由此得出結(jié)論，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度低，特異度高，陽性有助于結(jié)核性胸膜炎的診斷，同時檢測利福平耐藥也很準確。

總之，GeneXpert MTB/RIF在胸腔積液中的敏感度低，在臨床實踐中對結(jié)核性胸膜炎診斷的應用價值有限。

2. miRNA：目前針對結(jié)核性胸腔積液與其他類型胸腔積液，應用miRNA定量檢測進行鑒別診斷的研究相對較少，大部分數(shù)據(jù)來源于惡性胸腔積液特異性miRNA的研究，其中大多將結(jié)核性胸腔積液與其他類型胸腔積液合并為良性胸腔積液，與惡性胸腔積液進行鑒別診斷。

miR-198在惡性胸腔積液中的表達明顯低于結(jié)核性胸腔積液和炎性胸腔積液，與癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和細胞角蛋白19的片段(cytokeratin 19 fragment antigen，Cyfra21-1)聯(lián)合后效果更好。焦昕和劉寧[38]的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和血清中 miR-29a 和 miR-144 的表達明顯高于惡性胸膜疾病患者，而且在抗結(jié)核治療后表達下調(diào)，提示臨床上定量檢測血及胸腔積液中miR-29a和miR-144的水平，可能有助于鑒別診斷結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液，并可用于判定結(jié)核病的活動性。來自不同體液和細胞的研究結(jié)果提示，miR-29和miR-144可作為結(jié)核性胸膜炎診斷的潛在標志物。各項研究中發(fā)現(xiàn)的miRNA種類不同，可能與各研究納入的組別不同有關(guān)[39-41]。

目前尚無確定的、商業(yè)化的 miRNA 組合用于臨床診斷，可能與胸腔積液中 miRNA 含量低、定量檢測技術(shù)待優(yōu)化以及尚無研究開展基于大樣本的篩選和驗證導致樣本覆蓋程度不足等原因有關(guān)。相對于細胞或組織而言，依靠現(xiàn)有技術(shù)鑒定獲得的胸腔積液miRNA種類相對較少，表達量也相對較低，給胸腔積液特異性miRNA的篩選和鑒定帶來了一定的困難。但隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展甚至是三代測序技術(shù)的應用，胸腔積液miRNA的測序深度會越來越高；敏感度更高的數(shù)字PCR的應用也將極大提高胸腔積液miRNA 的檢出率；目前已有公司研發(fā)的miRNA預擴增試劑盒可以實現(xiàn)對低表達量miRNA的檢測[42]。相信隨著這些技術(shù)的不斷進步，胸腔積液miRNA定量檢測方法將會越來越簡化。此外，對于現(xiàn)已篩選獲得的特異性miRNA在結(jié)核性胸膜炎發(fā)生和發(fā)展中的作用機制仍然未知。因此，尚需要設計大樣本量的橫向和縱向研究，闡明miRNA在疾病中的調(diào)節(jié)機制和作用，以確保特異性miRNA在結(jié)核性胸膜炎鑒別診斷中的可靠性和實用性。

三、總結(jié)與展望

盡管結(jié)核性胸膜炎的實驗室研究已經(jīng)取得了很大進展，但目前尚無確診結(jié)核性胸膜炎的獨立生物標志物檢測方法。ADA和IFN-γ具有良好的敏感度和特異度，可作為結(jié)核性胸膜炎的特定生物標志物；IL-27是一種很有前途的生物標志物。然而，在常規(guī)試驗中加入IL-27和IFN-γ檢測，會增加試劑和分析成本，不利于在基層臨床實驗室廣泛使用。我們已進入應用NAATs和GeneXpert MTB/RIF進行結(jié)核病診斷的分子檢測時代，雖然這些檢測技術(shù)對結(jié)核病和耐多藥結(jié)核病有很大的價值，但它們在結(jié)核性胸膜炎診斷方面的性能還不盡如人意。目前尚無確定的、商業(yè)化的miRNA組合用于臨床診斷，可能與胸腔積液中miRNA含量低、定量檢測技術(shù)待優(yōu)化等原因有關(guān)。今后的研究重點將聚焦于炎癥反應不同階段的潛在生物標志物的聯(lián)合診斷、基因測序技術(shù)的更新等方面?？紤]到我國為結(jié)核病高負擔國家，未來的挑戰(zhàn)仍是開發(fā)出具有高效、低價、易操作的實驗室檢測方法，便于基層廣泛開展。