柳喜鳳，張東晨(.河北省保定市第一中心醫(yī)院公共衛(wèi)生科，保定 07000；2.河北省保定市第一中心醫(yī)院皮膚科，保定 07000)

皮膚癌是臨床常見疾病，在長期受到紫外線照射或吸煙人群中的發(fā)病率較高[1]。皮膚癌的長期進展會影響患者的外貌，還導(dǎo)致患者病死率升高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。手術(shù)治療能顯著提高皮膚癌患者的生存率，但對于腫瘤病灶大、位置特殊的患者，術(shù)后創(chuàng)傷形成的瘢痕會給患者帶來強烈的精神痛苦[3]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolaevulinic acid，5-ALA)是新一代的光敏感劑，可導(dǎo)致細(xì)胞中原卟啉IX(protoporphyrin IX，PPIX)蓄積[4]。光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種以光、光敏劑和氧分子相互作用為基礎(chǔ)的非侵襲性治療技術(shù)，可選擇性破壞靶細(xì)胞、組織，還具有一定美容效果[5]。研究發(fā)現(xiàn)，病變部位PPIX的蓄積是影響ALA-PDT療效的重要因素[6]。而三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2(ATP-binding cassette transporter group 2，ABCG2)可調(diào)節(jié)內(nèi)源性PPIX水平，過度表達會引起胞內(nèi)PPIX水平降低[7]。ABCG2抑制劑可恢復(fù)三陰性乳腺癌細(xì)胞對ALA-PDT的敏感性[8]。但ABCG2抑制劑對ALA-PDT治療皮膚癌的影響尚鮮有研究。本研究將探討ABCG2抑制劑Ko-143對ALA-PDT誘導(dǎo)不同皮膚癌細(xì)胞凋亡的影響，以期為提高ALA-PDT對皮膚癌的療效提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 恒溫培養(yǎng)箱(型號TY10GI2-2，美國Shellab公司)；酶標(biāo)儀(型號Stat Fax-2100，美國Awareness公司)；流式細(xì)胞儀(型號Guauasoft 6L，美國Millipor公司)；凝膠成像儀(型號GelDocEZ，美國Bio-Rad公司)。

1.2試藥 人皮膚基底癌細(xì)胞TE354.T、人皮膚鱗癌細(xì)胞SCL-1(貨號HTX2117C、HTX2657C，深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；5-ALA(貨號YJ3004833，上海一基實業(yè)有限公司)；ABCG2抑制劑Ko-143(貨號A11475，美國Adooq Bioscience公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(貨號CP680110A，上海冠導(dǎo)生物工程有限公司)；MTT試劑盒(貨號M1020，北京索萊寶科技有限公司)；Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號SNM530-FNI)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(貨號ARB10949)，丙二醛(malonydialdehyed，MDA)檢測試劑盒(貨號ARB12124)，均購自北京百奧萊博科技有限公司；PPIX抗體(貨號ab235595)，ABCG2抗體(貨號ab229193)，B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(貨號ab32124)，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(貨號ab182734)，活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)抗體(貨號ab49822)，GAPDH抗體(貨號ab59164)，羊抗兔lgG(貨號 ab205718)，均購自Abcam公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) TE354.T、SCL-1細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含質(zhì)量濃度為1 g·L-1胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)皿放在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，1～2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底部80%左右時，用質(zhì)量濃度為0.025 g·L-1的胰酶消化成單個細(xì)胞傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.2MTT法檢測TE354.T和SCL-1細(xì)胞增殖 取對數(shù)期TE354.T、SCL-1細(xì)胞，使用培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液的密度調(diào)整為1×105個·mL-1，以每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板。設(shè)置對照組、ALA-PDT組、Ko-143組和ALA-PDT+Ko-143組，每組6個復(fù)孔。對照組細(xì)胞不進行干預(yù)；ALA-PDT組細(xì)胞加入終濃度為2 mmol·L-1的5-ALA，避光孵育4 h，進行光照密度為10 J·cm-2(20 mW·cm-2，500 s)的PDT處理[9]；Ko-143組加入終濃度為10 μmol·L-1的ABCG2抑制劑Ko-143[10]；ALA-PDT+Ko-143組加入終濃度為2 mmol·L-1的5-ALA及終濃度為10 μmol·L-1的Ko-143，避光孵育4 h，進行光照密度為10 J·cm-2(20 mW·cm-2，500 s)的ALA-PDT處理。處理結(jié)束后放回培養(yǎng)箱中再孵育20 h，每孔加入3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍[3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]10 μL，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞砜(dimethylsurfoxide，DMSO) 150 μL，避光振蕩溶解，測定各孔450 nm處的吸光度(A)，計算增殖抑制率。增殖抑制率=[(A對照組-A實驗組)/A對照組]×100%。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測TE354.T和SCL-1細(xì)胞凋亡 取對數(shù)期TE354.T、SCL-1細(xì)胞，使用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液的密度為1×105個·mL-1，以每孔500 μL細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，按2.2項下方法對細(xì)胞進行分組和處理。處理結(jié)束后，放回培養(yǎng)箱中孵育20 h，收集細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后洗滌。將Annexin-VFITC、PI和結(jié)合緩沖液按1∶2∶50配制成Annexin-V-FITC/PI染液，使用Annexin-V-FITC/PI染液將細(xì)胞重懸，使其成為密度為1×107個·mL-1的細(xì)胞懸液，室溫避光孵育15 min，在流式細(xì)胞儀上樣，檢測細(xì)胞凋亡率。

2.4ELISA法檢測TE354.T和SCL-1細(xì)胞中的GSH-Px活性、MDA含量 取對數(shù)期TE354.T、SCL-1細(xì)胞，使用培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液的密度調(diào)整為1×105個·mL-1，以每孔500 μL細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，按2.2項下方法進行分組和處理。處理結(jié)束后，放回培養(yǎng)箱中孵育20 h。收集細(xì)胞，經(jīng)消化后洗滌，在冰上將細(xì)胞制成勻漿后離心，取上清，參照ELISA試劑盒說明書中步驟，測定450 nm處各組樣品與標(biāo)準(zhǔn)物的A值，用標(biāo)準(zhǔn)物濃度及相應(yīng)A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算TE354.T、SCL-1細(xì)胞中GSH-Px的活性和MDA的含量。

2.5蛋白印跡法檢測TE354.T和SCL-1細(xì)胞中PPIX、ABCG2、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達 取對數(shù)期TE354.T、SCL-1細(xì)胞，使用培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液的密度調(diào)整為1×105個·mL-1，以每孔500 μL細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，按2.2項下方法進行分組和處理。處理結(jié)束后，放回培養(yǎng)箱中孵育20 h，收集細(xì)胞并用裂解液裂解，提取總蛋白并測定濃度，取適量樣本，加Buffer緩沖液并用沸水浴處理，使其變性，經(jīng)凝膠電泳分離、半干法轉(zhuǎn)膜和脫脂奶粉封閉后，加入按1∶800稀釋的一抗(PPIX抗體、ABCG2抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleaved caspase-3抗體和GAPDH抗體)，4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次(10 min·次-1)，加入按1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次，增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)發(fā)光顯色，凝膠成像儀采集圖片，用Image J軟件分析灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

3 結(jié)果

3.1Ko-143對ALA-PDT誘導(dǎo)TE354.T和SCL-1細(xì)胞增殖抑制的影響 與對照組相比，ALA-PDT組和Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)；與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組TE354.T和SCL-1細(xì)胞增殖抑制率比較Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rates of TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.2Ko-143對ALA-PDT誘導(dǎo)TE354.T和SCL-1細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比，ALA-PDT組和Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。見圖1和表2。

表2 各組TE354.T和SCL-1細(xì)胞凋亡率比較Tab.2 Comparison of apoptosis rate of TE354.T and SCL-1 cells in each group

圖1 各組TE354.T和SCL-1細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Apoptosis of TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.3Ko-143對ALA-PDT誘導(dǎo)TE354.T和SCL-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對照組相比，ALA-PDT組和Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量均顯著升高(P<0.05)；與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量均顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中GSH-Px活性和MDA含量比較 Tab.3 Comparison of GSH-Px activity and MDA content in TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.4Ko-143對ALA-PDT誘導(dǎo)TE354.T和SCL-1細(xì)胞中ABCG2和PPIX蛋白表達的影響 與對照組相比，ALA-PDT組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中ABCG2的表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，PPIX蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中ABCG2蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，PPIX蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中ABCG2蛋白表達水平均顯著降低，PPIX蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。見圖2和表4。

圖2 各組TE354.T和SCL-1細(xì)胞中ABCG2和PPIX的蛋白表達水平

表4 各組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中ABCG2和PPIX蛋白表達水平比較Tab.4 Comparison of ABCG2 and PPIX protein expression levels in TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.5Ko-143對ALA-PDT誘導(dǎo)TE354.T和SCL-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組相比，ALA-PDT組、Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中Bcl-2/Bax蛋白的表達水平均顯著降低(P<0.05)，Cleaved caspase-3蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)。與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中Bcl-2/Bax蛋白的表達水平均顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表5和圖3。

表5 各組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達水平比較Tab.5 Comparison of the expression levels of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in TE354.T and SCL-1 cells in each group

圖3 各組TE354.T和SCL-1細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達水平注：A～D分別為TE354.T細(xì)胞對照組、ALA-PDT組、Ko-143組和ALA-PDT+Ko-143組；E～H分別為SCL-1細(xì)胞對照組、ALA-PDT組、Ko-143組和ALA-PDT+Ko-143組。Fig.3 Expression of Bcl-2，Bax，cleaved caspase-3 in TE354.T and SCL-1 cells in each groupNotes:A-D were control group，ALA-PDT group，Ko-143 group and ALA-PDT+Ko-143 group of TE354.T cell，respectively; E-H were control group，ALA-PDT group，Ko-143 group and ALA-PDT+Ko-143 group of SCL-1 cell，respectively.

4 討論

皮膚是最大的人體器官，能夠保護機體免于發(fā)生物理損傷，然而，皮膚在長時間的紫外線或輻射等的照射下，會出現(xiàn)皮膚組織細(xì)胞中DNA的斷裂，引起皮膚癌變[11]。皮膚基底細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌是分別由多能性基底樣細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生而形成的腫瘤，在惡性皮膚腫瘤中的發(fā)病率居前兩位，近年來其發(fā)病率不斷升高[12]。目前治療皮膚癌的方法有很多，如手術(shù)、激光、冷凍、放療和化療等，其中手術(shù)治療療效顯著，為首選治療方案，但其在治療某些特殊患者時具有很大的局限性，存在創(chuàng)面大、遺留疤痕、不良反應(yīng)多和美容效果欠佳等缺點[13]。因此，尋找更合適的治療手段對于皮膚癌的治療具有重要意義。

ALA-PDT是新興起的皮膚腫瘤的治療方式，近年來，由于其具有創(chuàng)傷小、痛苦少、無皮損部位限制等優(yōu)勢，在皮膚淺表腫瘤的治療中逐漸得到廣泛應(yīng)用。PDT是通過特定波長的激光激活光敏劑，同時與分子氧發(fā)生作用，從而產(chǎn)生活性氧分子，通過氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞膜或蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。5-ALA是一種血紅蛋白合成中間物，在體內(nèi)的量較少，但某些代謝旺盛的腫瘤細(xì)胞可選擇性吸收、積累進入體內(nèi)的外源性5-ALA[15]。5-ALA被腫瘤細(xì)胞吸收后代謝為內(nèi)源性光敏劑PPIX，具有強光敏作用，在特定波長激光的照射下會被激活生成單態(tài)氧，進而殺傷細(xì)胞，達到治療腫瘤的目的[13，16]。因此，ALA-PDT對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用與腫瘤細(xì)胞中PPIX的蓄積水平有關(guān)。本研究顯示，ALA-PDT可以顯著提高TE354.T、SCL-1細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率，并降低Bcl-2/Bax蛋白的表達水平，提高Cleaved caspase-3蛋白的表達水平，提示ALA-PDT可以下調(diào)抑凋亡成員Bcl-2與促凋亡成員Bax的比值，并提高caspase-3活性，抑制皮膚基底細(xì)胞癌TE354.T細(xì)胞、皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。GSH-Px是重要的抗氧化酶，可阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，而MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，是檢測氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要參考指標(biāo)[17]。本研究顯示，ALA-PDT可以顯著提高TE354.T、SCL-1細(xì)胞中PPIX蛋白的水平及MDA的含量，降低GSH-Px的活性，提示ALA-PDT會導(dǎo)致TE354.T、SCL-1細(xì)胞中PPIX蛋白蓄積，進而提高氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致TE354.T、SCL-1細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷并凋亡。

ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，在腫瘤中普遍高表達，其會主動將化療藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致癌細(xì)胞耐藥[18]。孫偉等[19]研究表明，ABCG2介導(dǎo)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)PPIX的外流，使用白藜蘆醇抑制ABCG2的表達可增加細(xì)胞內(nèi)PPIX的含量，從而提高PDT療效。Ko-143是一種有效且具有相對選擇性的ABCG2抑制劑，是ABCG2特異性抑制劑煙曲霉毒素C(fumitremorgin C，F(xiàn)TC)的衍生物，對ABCG2的抑制作用是FTC的10倍[10]。本研究顯示，使用Ko-143輔助ALA-PDT處理TE354.T、SCL-1細(xì)胞后，細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達水平均顯著降低，同時PPIX蛋白的表達水平均顯著升高，提示Ko-143在顯著抑制ABCG2蛋白表達的同時，還能夠使PPIX在胞內(nèi)蓄積。同時，與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細(xì)胞中GSH-Px的活性及Bcl-2/Bax蛋白的表達水平顯著降低，MDA含量及Cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均顯著升高，提示Ko-143抑制ABCG2蛋白表達后，可提高ALA-PDT作用下細(xì)胞內(nèi)PPIX蛋白的蓄積量，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，提高ALA-PDT對TE354.T、SCL-1細(xì)胞增殖的抑制及對凋亡的促進能力。

綜上所述，ABCG2抑制劑Ko-143能抑制ABCG2的表達，提高PPIX蛋白在胞內(nèi)的蓄積水平，對ALA-PDT誘導(dǎo)TE354.T、SCL-1細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡具有促進作用，對臨床減少ALA-PDT抵抗、提高ALA-PDT療效可能具有一定價值。