馬英華，張古英，趙宜樂，韓 雨，姜錫娟，解偉偉，安 娜，安志華，秦亞彬 (.河北省兒童醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 05003；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000)

在抗擊新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)時(shí)[1]，中醫(yī)藥與西藥相輔相成，做出了巨大貢獻(xiàn)[2-3]。桔梗為桔?？浦参锝酃Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.]的干燥根[4]。甘草為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根和根莖[5]。桔梗和甘草配伍，最早來源于中醫(yī)經(jīng)典《傷寒論》中的桔梗湯，主要用于治療肺熱咽痛、肺熱咳嗽、肺癰等證[6]。桔梗-甘草藥對(duì)經(jīng)加味可以演化為清金化痰湯、托里消毒散、清肺湯等經(jīng)典名方[7-8]。同時(shí)，桔梗和甘草是在COVID-19的治療中高頻次出現(xiàn)的中藥[9]。但桔梗-甘草藥對(duì)干預(yù)COVID-19的作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)整體角度出發(fā)，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)進(jìn)行多成分-多靶點(diǎn)的系統(tǒng)研究，廣泛應(yīng)用于中藥研究中，而分子對(duì)接更能從藥物分子設(shè)計(jì)的角度佐證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果[10-11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，探討并驗(yàn)證桔梗-甘草藥對(duì)干預(yù)COVID-19的作用機(jī)制，以期為治療COVID-19提供理論支持。

1 資料與方法

1.1活性成分和靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞“桔?！焙汀案什荨?，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件，篩選出藥效活性成分。同時(shí)預(yù)測(cè)成分潛在作用靶點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot(https://www.uniprot.org/)和perl腳本程序?qū)Π悬c(diǎn)基因的名稱進(jìn)行轉(zhuǎn)換，校正為官方的縮寫名稱。

1.2疾病靶點(diǎn)篩選 利用基因數(shù)據(jù)庫Gene Cards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)，對(duì)關(guān)鍵詞“COVID-19”和“novel coronavirus”進(jìn)行檢索，限定選擇相關(guān)度≥1的靶點(diǎn)，收集疾病靶點(diǎn)。

1.3藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 安裝R語言軟件R×64 4.0.2，在R語言上安裝Venny 2.1.0，將藥物與疾病靶點(diǎn)取交集繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)文檔，并運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用STRING(https://string-db.org/)網(wǎng)站，將1.3項(xiàng)下得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，物種限定為“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值“medium confidence”為0.7，隱藏離散點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果以tsv的格式導(dǎo)出，備用。將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，運(yùn)用CytoNCA插件對(duì)交集基因進(jìn)行打分篩選，得到核心基因。

1.5通路富集分析 使用perl腳本，將交集靶點(diǎn)的symbol 轉(zhuǎn)換為基因ID，再次使用R語言軟件，安裝Bioconductor數(shù)據(jù)庫安裝包，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO(gene ontology)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，最終得到GO分析的柱形圖、KEGG通路分析的氣泡圖和通路途徑圖。

1.6活性分子與靶點(diǎn)蛋白對(duì)接 從PubChem(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載活性成分(Degree≥11)的二維化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用Chem Office 3D 18.1.0軟件轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)碼為mol2格式文件，備用。從RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載Mpro(PDB ID：6LU7)和ACE2(PDB ID：1R42)的3D結(jié)構(gòu)，應(yīng)用PyMOL軟件進(jìn)行去水分子和去有機(jī)物操作，備用。將上述活性化合物和蛋白結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行優(yōu)化操作，設(shè)置蛋白活性口袋，定義盒子大小為(40×40×40)個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)的距離(spacing)為1.0 nm，最后利用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1活性成分和靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢桔梗和甘草的成分，共收集到367種化學(xué)成分(桔梗102種，甘草265種)，設(shè)置參數(shù)(OB≥30%，DL≥0.18)進(jìn)行篩選，結(jié)果共篩選得到99種成分(桔梗7種，甘草92種)。同時(shí)，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選桔梗和甘草成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因，共獲得2 766個(gè)靶點(diǎn)。

2.2疾病靶點(diǎn)篩選 在數(shù)據(jù)庫Gene Cards、OMIM、TTD、PharmGkb和DrugBank中，以“COVID-19”和“novel coronavirus”為搜索詞，得到與COVID-19相關(guān)的靶點(diǎn)，設(shè)置相關(guān)度≥1，去重取并集，共獲得674個(gè)靶點(diǎn)。在R語言軟件中運(yùn)行腳本進(jìn)行韋恩圖繪制，對(duì)交集結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖1A，其中GeneCard 482個(gè)、OMIM 3個(gè)、TTD 100個(gè)、PharmGkb 9個(gè)、DrugBank 119個(gè)。

2.3活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 利用R語言軟件，繪制成分-靶點(diǎn)的韋恩圖，得到交集基因67個(gè)，見圖1B，并應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和可視化，見圖2。圓形表示靶點(diǎn)，長(zhǎng)方形表示甘草有效成分，倒三角形表示桔梗有效成分，連線表示二者之間的相互作用關(guān)系。如圖2所示，共有150個(gè)節(jié)點(diǎn)(83種成分和67個(gè)交集基因)和672條連線，此結(jié)果體現(xiàn)了中藥多成分多靶點(diǎn)共同作用的意義。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)分析，該網(wǎng)絡(luò)中所有靶點(diǎn)按度值(Degree)打分排序，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)大小用“Degree”表示，得到靶點(diǎn)的得分排序。度值越大表示靶點(diǎn)被越多的有效成分所靶向，說明靶向靶點(diǎn)對(duì)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵作用。而大于平均度值的交集基因有10個(gè)，分別為PTGS2(78)、ESR1(71)、NOS2(62)、PPARG(58)、GSK3B(53)、CDK2(53)、CCNA2(50)、MAPK14(43)、PTGS1(41)和DPP4(35)。

圖1 來自5個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)韋恩圖注：A.COVID-19疾病靶點(diǎn)韋恩圖；B.桔梗-甘草藥對(duì)與COVID-19交集靶點(diǎn)韋恩圖。Fig.1 Target Venn diagrams from 5 databasesNotes：A.Venn diagram of COVID-19 disease targets；B.Venn diagram of intersection targets in Platycodonis Radix-Licorice drug pair and COVID-19 disease.

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Drug-component-target interaction network

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及查找核心基因 將67個(gè)交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為人類，剔除離散靶點(diǎn)，篩選得分大于0.7的靶點(diǎn)，最終得到PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖3A)。運(yùn)用CytoNCA插件對(duì)交集基因進(jìn)行打分，篩選依據(jù)為中介中心性(betweenness centrality，BC)、緊密中心性(closeness centrality，CC)、程度中心性(degree centrality，DC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、本地平均水平連接性(local average connectivity，LAC)和網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality，NC)，若6項(xiàng)的評(píng)分均大于中位數(shù)，則將該基因保留，否則將其剔除(圖3B)。最后經(jīng)過2輪篩選，得到核心基因(圖3C)。最終核心基因包括RELA、STAT1、MAPK3、TP53、MAPK1、MAPK8、STAT3、MAPK14、IL1B和TNF(詳細(xì)節(jié)點(diǎn)參數(shù)見表1)。結(jié)果表明，桔梗-甘草藥對(duì)可能通過以上核心基因干預(yù)COVID-19的進(jìn)展。同時(shí)，將2.3項(xiàng)下的主要作用靶標(biāo)與PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因取交集，得到MAPK14基因，可以推測(cè)MAPK14基因不僅對(duì)藥材和疾病作用的影響大，而且在PPI網(wǎng)絡(luò)中居于重要地位，推斷這個(gè)靶點(diǎn)可能是桔梗-甘草藥對(duì)拮抗新型冠狀病毒的重要靶標(biāo)。

圖3 使用Cytoscape軟件構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖注：A.使用CytoNCA插件第一次過濾篩選出的各評(píng)分均高于中位數(shù)的倒三角節(jié)點(diǎn)；B.通過CytoNCA插件第二次過濾構(gòu)建的子網(wǎng)絡(luò)；C.最后使用CytoNCA插件2次篩選得到的核心基因。Fig.3 Establishing PPI network by using CytoscapeNotes:A.CytoNCA plug-in was used to filter out the yellow nodes whose scores were higher than the median for the first time；B.subnetwork constructed by a second filtration via CytoNCA；C.final core genes screened after two filtrations by using CytoNCA.

表1 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)蛋白拓?fù)鋮?shù)Tab.1 Topological parameters of core target proteins in PPI network

2.5GO富集分析和KEGG通路分析 經(jīng)分析，共獲得2 120個(gè)生物過程(biological process，BP)、38種細(xì)胞組分(cellular component，CC)和136個(gè)分子功能(molecular function，MF)，篩選各組分前10個(gè)富集最顯著的GO分析(圖4)，其中BP主要與抗氧化反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)和對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)等相關(guān)，CC 主要集中在細(xì)胞膜活性上，而MF主要與細(xì)胞因子活性和受體結(jié)合相關(guān)。以上結(jié)果提示桔梗-甘草藥對(duì)的靶點(diǎn)主要與細(xì)菌和病毒感染等密切相關(guān)。通過KEGG通路分析，共獲得166條信號(hào)通路，選取前30條富集最顯著的通路繪制氣泡圖，見圖5，其中x軸表示富集因子(rich factor)，即背景基因集中在這個(gè)通路的所有基因的數(shù)量，y軸表示通路名稱，氣泡顏色表示P值大小，氣泡大小表示基因數(shù)量。如圖5所示，富集通路涉及Coronavirus disease-COVID-19通路，涉及的其他通路大致可分為免疫反應(yīng)相關(guān)通路、炎癥相關(guān)通路、抑制病毒感染通路和抑制癌癥的相關(guān)通路。以上結(jié)果提示桔梗-甘草藥對(duì)可能通過干預(yù)這些信號(hào)通路來抑制COVID-19的進(jìn)展。

圖4 桔梗-甘草藥對(duì)干預(yù)COVID-19的GO富集分析結(jié)果Fig.4 GO enrichment analysis of Platycodonis Radix-Licorice drug pair for intervention against COVID-19

圖5 桔梗-甘草藥對(duì)干預(yù)COVID-19的KEGG富集分析結(jié)果Fig.5 KEGG enrichment analysis of Platycodonis Radix-Licorice drug pair for intervention against COVID-19

2.6核心活性成分與ACE2和Mpro的分子對(duì)接 分子對(duì)接技術(shù)通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)對(duì)主要活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行模擬研究，從而簡(jiǎn)單驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，其結(jié)合自由能越小，則配體與受體的親和力越大，從而側(cè)面佐證活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)存在相互作用。一般結(jié)合自由能小于-5.0 kcal·mol-1則認(rèn)為模擬成功，小于-7.0 kcal·mol-1則認(rèn)為兩者有較好的結(jié)合能力。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中得到的前11種活性成分(Degree≥11)分別與ACE2和Mpro進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算結(jié)合自由能，采用最小的結(jié)合構(gòu)象，結(jié)果見表2。同時(shí)，自由能最小的前4種活性化合物(鱗葉甘草素A、槲皮素、甘草查爾酮A和木犀草素)的分子對(duì)接圖見圖6。

表2 核心活性成分與SARS-CoV-2的結(jié)合位點(diǎn)Mpro和ACE2分子對(duì)接效能Tab.2 Molecule docking efficiency of core active components with Mpro and ACE2 at the binding sites of SARS-CoV-2

圖6 活性成分與ACE2和Mpro的分子對(duì)接模式Fig.6 Molecular docking diagram of active ingredients with ACE2 and Mpro

3 討論

目前對(duì)于COVID-19缺乏特效治療藥物，根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第8版)》(國(guó)衛(wèi)辦函)，治療以抗病毒、抗感染、免疫治療和對(duì)癥治療為主。在中醫(yī)理論背景下[12]，COVID-19屬于中醫(yī)疫病范疇[13]，其病因主要是感受“疫戾”之氣，病理因素主要以濕為主，伴隨毒和瘀，入肺化熱，所以初期治療以清熱解毒化濕為主[14]。從古至今，中醫(yī)藥在各種瘟疫病的治療中都發(fā)揮著重要作用[15]。經(jīng)典藥對(duì)桔梗和甘草合用，對(duì)COVID-19有一定的防控作用。但是，其對(duì)COVID-19的治療作用尚缺乏直接證據(jù)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)系統(tǒng)分析了經(jīng)典藥對(duì)桔梗-甘草干預(yù)COVID-19的潛在作用機(jī)制。從現(xiàn)存的中藥數(shù)據(jù)庫中獲得靶標(biāo)信息，篩選出99種活性成分，并與COVID-19疾病靶標(biāo)取交集，獲得67個(gè)交集靶點(diǎn)，通過對(duì)關(guān)鍵交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析和篩選，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)MAPK14。MAPK14，即p38α，是p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)家族成員之一[16]。MAPK14作為MAPK家族中的重要成員之一，其表達(dá)與機(jī)體生理功能密切相關(guān)，表達(dá)異?？梢l(fā)機(jī)體免疫功能失調(diào)，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，同時(shí)也與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。當(dāng)機(jī)體受到不同理化因素、炎性因子、脂多糖、紫外線照射等刺激后，可通過活化MAPK14蛋白來激活p38MAPK通路，從而啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。因此，推測(cè)桔梗-甘草藥對(duì)可能通過調(diào)控MAPK14蛋白的表達(dá)而起到抑制病毒的作用。通過對(duì)關(guān)鍵交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，其BP主要與抗氧化反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)密切相關(guān)，表明桔梗-甘草藥對(duì)可能具有抗病毒和抗感染的作用。而KEGG通路分析結(jié)果則顯示桔梗-甘草藥對(duì)干預(yù)COVID-19的通路大致可以分為免疫反應(yīng)相關(guān)通路、炎癥相關(guān)通路、抑制病毒感染通路和抑制癌癥的相關(guān)通路，該結(jié)果提示桔梗-甘草藥對(duì)可能通過多渠道、多通路抑制COVID-19的進(jìn)展。

新型冠狀病毒于2020年2月11日被國(guó)際病毒分類委員會(huì)命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus，SARS-CoV)、中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome-coronavirus，MER-SCoV)一樣，同屬于β屬的冠狀病毒[18-19]，2019-nCoV與SARS-CoV的基因序列同源性高達(dá)79%，與MER-SCoV序列的同源性也達(dá)到了40%左右，且三者都是通過刺突糖(spike glycoprotein，S)蛋白的表達(dá)與人體黏膜上皮細(xì)胞膜表面的ACE2的受體結(jié)合而入侵機(jī)體，繼而大量復(fù)制，導(dǎo)致肺炎[20-21]。而ACE2作為炎癥因子調(diào)節(jié)蛋白[22]，通過酪氨酸蛋白磷酸化，激活MAPK受體，誘導(dǎo)激活促炎因子，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而損害組織細(xì)胞[23]。因此，活性成分與Mpro和ACE2的靶點(diǎn)結(jié)合能有效抑制病毒的進(jìn)一步入侵，從而減輕病毒感染的程度。目前，利用分子對(duì)接技術(shù)模擬、驗(yàn)證活性成分與病毒靶點(diǎn)的結(jié)合，初步篩選出能與化學(xué)抗病毒藥物相匹敵的活性成分，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定了理論基礎(chǔ)，也為這些活性成分能夠成為抗病毒藥提供了理論依據(jù)，既減少實(shí)驗(yàn)資源的盲目浪費(fèi)，又為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，中藥經(jīng)典藥對(duì)桔梗-甘草干預(yù)COVID-19是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同方式實(shí)現(xiàn)，為COVID-19的中醫(yī)防治提供了可行性理論參考。同時(shí)，通過分子對(duì)接分析藥對(duì)的核心成分，也為新藥的開發(fā)提供了新方向，縮短了用于篩選有效化合物的時(shí)間，提高了新藥開發(fā)的效率。但是本研究也存在一定的局限性，即預(yù)測(cè)的理論結(jié)果還需后期的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，才能為COVID-19的中醫(yī)防治提供更可靠的理論和數(shù)據(jù)支持。