徐聯(lián)鵬，吳 萍，陸晨暉，張繼緒，陳 娟，吳雨龍

(1. 南京曉莊學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211171；2. 江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點建設(shè)實驗室，江蘇 南京 211171)

硒是人類和動物必需的微量營養(yǎng)素,是硒酶和硒蛋白的活性中心，在生物體的能量代謝和基因表達(dá)中起著重要作用[1].因此，它具有多種生物活性功能，如抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤等[2-6].正常情況下，人體生理硒攝入量以40～200 μg/d為宜，最大耐受量為400 μg/d，過低或過高都會引起機(jī)體異常.缺硒會引發(fā)克山病和大骨節(jié)病等，而攝入過量硒則會引起關(guān)節(jié)疼、脫發(fā)、腹瀉等癥狀[7,8].然而，據(jù)統(tǒng)計，全球約5～10億人口面臨硒攝入不足問題，我國約72%的地區(qū)處于低硒狀態(tài)[9].研究表明，有機(jī)硒比無機(jī)硒更容易被機(jī)體吸收利用，而通過生物轉(zhuǎn)化將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的富硒作物由于生物利用度和安全性高，被認(rèn)為是許多缺硒地區(qū)補(bǔ)硒的最佳選擇[10].

食用菌除自身含有豐富的蛋白質(zhì)和多種營養(yǎng)元素，還具有較強(qiáng)的將環(huán)境中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為安全高效有機(jī)硒的能力[11-14].與富硒研究較為成熟的糧食作物相比，食用菌具有不與糧爭地，不與地爭肥，不與農(nóng)爭時，富硒效率高，富硒樣式多，生長周期短，價格成本低等優(yōu)勢[15].何炎炘等[16]培養(yǎng)富硒金針菇時發(fā)現(xiàn)，富硒能夠提高菌絲體中多糖、蛋白等營養(yǎng)素的含量.魏云輝等[17]在培育富硒猴頭菌時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)料中硒添加量在20 mg/kg時，菌絲體生長速率提高，產(chǎn)量增加，采收期縮短，子實體大而白.梁英等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在香菇培養(yǎng)料中添加硒的濃度低于80 mg/kg時，出菇時間提前，菌絲生長速度快，發(fā)菌時間短，子實體產(chǎn)量增加，子實體硒含量比空白對照組香菇高300多倍，當(dāng)硒添加量高于80 mg/kg時，結(jié)果相反.秀珍菇作為一種營養(yǎng)豐富、清甜爽口、價格低廉、市場廣闊，深受廣大消費者喜愛的一種食用菌[19]，若作為富硒載體投放缺硒地區(qū)，不乏為一種較好的補(bǔ)硒方式.本研究在秀珍菇常規(guī)培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上，向栽培原料中添加不同濃度的無機(jī)亞硒酸鈉溶液，以探究對秀珍菇菌絲生長速度、子實體硒含量、子實體產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，為進(jìn)一步開發(fā)培育富硒秀珍菇提供可靠的技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秀珍菇菌種、麩皮、棉籽殼，由南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院菌物研究所提供.

亞硒酸鈉，廣州市長華化工有限公司；Se標(biāo)準(zhǔn)液(1000 mg/L)，購買于上海赫澎生物科技有限公司；葡萄糖、瓊脂、鐵氰化鉀、高氯酸、硝酸、鹽酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱、GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DFY-200C搖擺式高速粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；Milestone微波消解儀意大利Milestone公司；7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，安捷倫科技有限公司；NAI-DTY凱氏定氮儀，上海那艾精密儀器有限公司；L8900氨基酸分析儀，日立有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 秀珍菇菌種活化

取200 g削皮土豆，切塊放入鍋中，加入1000 mL水熬煮至沸騰，維持20～30 min，隨后用兩層紗布趁熱過濾，棄去濾渣，再將濾液補(bǔ)充至1000 mL，將濾液倒回鍋中，加入20 g葡萄糖并攪拌，再稱取15 g瓊脂粉加入，加熱并不停攪拌，防止糊底，充分溶解后，補(bǔ)充水分至1000 mL，將液體趁熱分裝于錐形瓶中，于121 ℃條件下，滅菌20 min.在超凈工作臺中，將滅菌后的培養(yǎng)基倒入平板中，待培養(yǎng)基凝固后，將秀珍菇菌種接入新鮮的培養(yǎng)基平板中活化，放置在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d(培養(yǎng)1 d后將平板倒置)，待菌絲長滿平板，活化完成.

1.2.2 秀珍菇培養(yǎng)配方

試驗在參考閆鴻媛[20]方法的基礎(chǔ)上，稍作修改，設(shè)置了空白組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ共6個配方.將棉籽殼、麩皮、石灰、石膏按照比例(82∶15∶2∶1)加入攪拌機(jī)，加適量的水使含水量控制在60%～65%，拌勻，隨后均分成六份，除空白組，Ⅰ～Ⅴ分別加入15、25、35、45、55 mg/kg溶解后的亞硒酸鈉溶液，每個配方10袋，每袋培養(yǎng)料600 g.

1.2.3 秀珍菇出菇管理

將活化后的菌種接入滅菌后的菌袋置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后觀察菌絲萌發(fā)情況，記錄觀測菌絲長勢以及用游標(biāo)卡尺測量菌絲的生長速度.將發(fā)菌完成的菌袋放置于出菇房中出菇，每天噴三次水，每次噴10 min，保持出菇房濕度≥75%，出菇完成后，進(jìn)行采摘并記錄數(shù)據(jù).

1.2.4 微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定富硒秀珍菇有機(jī)硒含量

1.2.4.1 樣品的前處理

將前期采摘的富硒秀珍菇50 ℃烘干，粉碎，過60目篩.準(zhǔn)確稱取富硒秀珍菇粉末0.300 g，將樣品置于10 mL玻璃比色管中，用2%的硝酸定容，超聲處理20 min.取出樣品，冷卻、過濾，加熱蒸發(fā)掉大部分溶劑后，分別倒入聚四氯乙烯消解罐中，加入5 mL HNO3-HClO4(V1∶V2=9∶1)，放入微波消解儀中消解：保持時間15 min，功率1300 W，消解罐8個，溫度由120 ℃上升到180 ℃.將冷卻后的樣品取出，將消解液倒入錐形瓶中，放于電熱板上加熱，直至液體幾乎蒸發(fā)殆盡.隨后，再向錐形瓶中加入5 mL HCl(6 mol/L)，繼續(xù)用電熱板加熱，直至試樣變?yōu)闊o色清澈.待消解液冷卻后，倒入10 mL容量瓶中，加入2.5 mL 100 g/L的鐵氰化鉀溶液，接著用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻，等待檢測.同法制備空白組.

1.2.4.2 硒含量測定

按表1設(shè)置電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)的主要工作參數(shù)，待儀器的各項指數(shù)穩(wěn)定時，測定樣品溶液中的硒含量.

表1 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)主要工作參數(shù)

1.2.4.3 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用6 mol/L的鹽酸將1 mL硒的標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 mg/L)稀釋為10 mg/L，分別取0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL和2 mL置于100 mL的容量瓶，加入10 mL鐵氰化鉀溶液(100 g/L)，定容，混勻.硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度依次為：0、0.5、1、2、20 g/L.按1.2.4.2的方法測定硒標(biāo)準(zhǔn)溶液中硒的含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=84.29x+66.72，R2=0.998.

1.2.5 秀珍菇營養(yǎng)成分含量的測定

根據(jù)Dong等[21]的研究方法對秀珍菇樣品中的營養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行測定.用純凈水(1∶30，g/ mL)在40 ℃(每次3 h)中提取10 g秀珍菇子實體干樣品中的多糖，用Sevag試劑(1-丁醇:氯仿，1∶4)進(jìn)行脫蛋白.隨后，采用苯酚-硫酸法測定粗多糖濃度.采用凱氏定氮法測定10 g秀珍菇子實體干樣品中總蛋白濃度，氮含量乘以4.38.采用索氏提取法測定5 g秀珍菇子實體干樣品中脂肪含量.秀珍菇子實體干樣品各20 mg分別用15 mL鹽酸(6 mol/L)水解后，用氨基酸分析儀測定水解液中氨基酸含量

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇菌絲生長的影響

由表2可知，隨著培養(yǎng)基中亞硒酸鈉添加量的增加，秀珍菇菌絲體的萌發(fā)天數(shù)，先減少后增加，其中Ⅲ組(亞硒酸鈉添加量為35 mg/kg時)的菌絲體萌發(fā)最快，僅需2 d；空白組的菌絲體萌發(fā)需要5 d，Ⅴ組的菌絲體萌發(fā)最慢，需要6 d.這表明，亞硒酸鈉的添加量對秀珍菇菌絲體的萌發(fā)有一定影響，在一定濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)菌絲體萌發(fā)，但當(dāng)添加量過高時，則會抑制菌絲體的萌發(fā).此外，Ⅲ組菌絲滿袋天數(shù)最短28 d.在菌絲生長速度方面，Ⅰ組～Ⅳ組的生長速度均比空白組快，而Ⅴ組的生長速度比空白組慢，其中Ⅲ組菌絲生長速度最快，為0.497 cm/d.Ⅲ組菌絲的長勢也是最好，菌絲潔白.由此可見，在亞硒酸鈉添加量為35 mg/kg時，秀珍菇菌絲生長最佳.可能的原因是，低濃度的亞硒酸鈉溶液能夠促進(jìn)秀珍菇菌絲的生長，而當(dāng)亞硒酸鈉溶液添加量超過一定濃度時，由于硒暴露產(chǎn)生活性氧(ROS)、脂質(zhì)過氧化和硫代謝下降從而抑制菌絲的生長[22].

表2 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇菌絲生長的影響

2.2 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇產(chǎn)量的影響

硒是大多數(shù)機(jī)體正常生理活動過程中必需的一種微量元素，而不同濃度、不同形態(tài)的外源硒對食用菌生長具有一定影響[23].Niedzielski等[24]研究發(fā)現(xiàn)，用0.4 mmol/L的亞硒酸鈉處理柱狀田頭菇，促進(jìn)子實體生長；當(dāng)處理濃度高于0.4 mmol/L時，子實體變??；當(dāng)處理濃度高于0.6 mmol/L時，則不能形成子實體.Hu等[25]研究富硒金針菇培育時發(fā)現(xiàn)，用低于30 mg/kg亞硒酸鈉處理金針菇時，促進(jìn)子實體的生長；當(dāng)處理濃度在40～200 mg/kg時，明顯抑制子實體的生長；當(dāng)處理濃度超過200 mg/kg時，則不能形成子實體.本研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中亞硒酸鈉添加量的增加，秀珍菇的總產(chǎn)量(按前三潮計算)及平均每潮產(chǎn)量是先增加后降低(圖1)，其中Ⅲ組(亞硒酸鈉添加量為35 mg/kg時)秀珍菇的總產(chǎn)量最高，且平均每潮產(chǎn)量也為最高，與空白組相比差異顯著(P<0.05).結(jié)果表明，適宜濃度的硒對秀珍菇的生長具有促進(jìn)作用，當(dāng)硒濃度超過一定值后則對秀珍菇具有毒害作用，從而抑制其生長.

圖1 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇產(chǎn)量的影響注：與空白組相比，*表示差異顯著P<0.05.

圖2 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇子實體硒含量的影響注：與空白組相比，*表示差異顯著P<0.05；**表示差異極顯著P<0.01.

2.3 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇中有機(jī)硒含量的影響

食用菌細(xì)胞壁上硫基、氨基等離子基團(tuán)的存在使其對硒元素具有高效的富集能力.食用菌通過菌絲細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)化，吸收外源無機(jī)硒，使之與機(jī)體中的蛋白質(zhì)、多糖等大分子活性物質(zhì)結(jié)合，轉(zhuǎn)化成硒蛋白和硒多糖等有機(jī)硒的形式[15].在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的無機(jī)硒酸鹽，利用食用菌的吸收轉(zhuǎn)化作用，將外源無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，從而得到富硒食用菌[20].本研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中亞硒酸鈉添加量的增加，秀珍菇子實體中有機(jī)硒的含量不斷增高，其中Ⅴ組(亞硒酸鈉添加量為55 mg/kg時)的秀珍菇子實體有機(jī)硒含量最高；與空白組相比，Ⅰ組～Ⅴ組秀珍菇子實體有機(jī)硒含量差異顯著(P<0.05，P<0.01)，見圖2.結(jié)果表明，在培養(yǎng)料中添加一定外源無機(jī)硒的范圍內(nèi)，隨著硒濃度的增加，秀珍菇子實體中有機(jī)硒含量也隨之增加.

2.4 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇中其他營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

在栽培料中添加適宜濃度的硒，不僅能夠增加食用菌中硒的含量，而且能夠一定程度上提高食用菌的品質(zhì).Turlo等[26]研究發(fā)現(xiàn)富硒香菇子實體多糖含量明顯高于空白組.Kaur等[27]研究表明富硒梭柄松苞菇子實體中蛋白質(zhì)的含量顯著高于空白組.Zhen等[28]經(jīng)亞硒酸鈉處理后的皺環(huán)球蓋菇菌絲總氨基酸含量比空白組增加了近13.5%.根據(jù)研究[29]，硒處理后食用菌營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化可能與以下因素有關(guān)：(1)樣品的耐受性和解毒能力；(2)硒的含量、形態(tài)和添加方法；(3)培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基、營養(yǎng)、時間、溫度等)；(4)使用的檢測方法.本研究中，隨著培養(yǎng)基中亞硒酸鈉添加量的增加，秀珍菇子實體中多糖、蛋白質(zhì)和總氨基酸的含量顯著增加，表明多糖、蛋白質(zhì)和總氨基酸合成的增加可能有助于儲存額外的有機(jī)硒和減輕亞硒酸鹽引起的毒性作用；而脂肪含量未發(fā)生變化，表明亞硒酸鈉處理對脂肪成分沒有影響(表3).因此，富硒可以提高秀珍菇的營養(yǎng)價值.

表3 不同濃度亞硒酸鈉對秀珍菇中營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響 單位：g/100g

3 結(jié)論

秀珍菇子實體能夠高效的將培養(yǎng)基中的無機(jī)硒(亞硒酸鈉)轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒.在一定硒添加范圍內(nèi)，當(dāng)亞硒酸鈉添加量為35 mg/kg時，秀珍菇菌絲生長速度最快(0.497 cm/d)，菌絲滿袋天數(shù)最短(28 d)，子實體產(chǎn)量最高(平均127.5 g/潮)；當(dāng)亞硒酸鈉添加量為55 mg/kg時，秀珍菇子實體中硒含量最高(2.812 μg/g)；隨著亞硒酸鈉添加量的增加，秀珍菇子實體中多糖、蛋白質(zhì)和總氨基酸的含量顯著增加，而脂肪含量不變.因此，富硒秀珍菇可以作為人類和牲畜的膳食硒補(bǔ)充來源，也可以作為一種功能性食品.