景蕓蕓，張玉富

(1.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

膠質(zhì)瘤是我國最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位于顱內(nèi)腫瘤前列[1]。雖然近年來包括手術(shù)切除、化療和放療在內(nèi)的多種治療方法不斷發(fā)展，但由于膠質(zhì)瘤術(shù)后易復(fù)發(fā)，對(duì)化療藥物敏感性差等原因，整體治療效果仍不理想[2]。因此，研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，探究具有早期診斷和評(píng)價(jià)預(yù)后價(jià)值的生物標(biāo)志物，從而為膠質(zhì)瘤的診療提供新的治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床價(jià)值。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的一種非編碼RNA。不同于傳統(tǒng)的線性RNA，circRNA無5′帽子結(jié)構(gòu)及3′polyA尾，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被常見的核酸外切酶降解，因此相比于線性RNA其表達(dá)更加穩(wěn)定，具有成為理想的腫瘤標(biāo)志物的潛能[3]。研究證明[4-6]，cricRNA可通過參與基因表達(dá)、腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移等，引起細(xì)胞功能缺陷或異常，從而在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，例如：肝癌、肺癌、乳腺癌等。在膠質(zhì)瘤中，也存在多種異常表達(dá)的circRNA為膠質(zhì)瘤患者診療及預(yù)后提供幫助，例如：circ_0005075可通過下調(diào)SIRT1來刺激膠質(zhì)瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[7]；circ_001680在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平明顯上調(diào)，通過靶向抑制miR-186-5p促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[8]；膠質(zhì)瘤中，過表達(dá)的環(huán)狀RNAhsa_circ_0133159可作為膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物，具有極高的臨床價(jià)值[9]。Circ_002136是與膠質(zhì)瘤相關(guān)的癌基因，以前的研究表明，其在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)明顯升高[10]，然而，circ_002136與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系尚未得到證實(shí)。因此，本研究的目的是通過檢測(cè)circ_002136的表達(dá)，探討circ_002136在膠質(zhì)瘤中的臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本與對(duì)應(yīng)癌旁組織取自2012年7月至2015年1月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科進(jìn)行手術(shù)切除的39例膠質(zhì)瘤患者，所有患者均在術(shù)前經(jīng)影像學(xué)檢查及術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為膠質(zhì)瘤，并進(jìn)行了WHO分級(jí)。其中男21例，女18例，年齡36～77歲。標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切取后立即在-80℃液態(tài)氮冷凍儲(chǔ)存直到RNA提取。所有患者均確診為膠質(zhì)瘤且排除以下情況：既往接受化療、放療、手術(shù)等任何抗癌治療者；生命體征不穩(wěn)定者；合并其他腫瘤者；合并嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病或凝血障礙者；隨訪資料缺失或失訪者；不同意參加者。隨訪數(shù)據(jù)通過定期電話聯(lián)系及患者復(fù)診面談的形式收集。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

參照說明書，使用TRIzol試劑(Invitrogen，CA，USA)從膠質(zhì)瘤組織及癌旁組織中提取總RNA。采用NanoDrop1000分光光度計(jì)(Nano Drop，Wilmington，DE，USA)測(cè)量RNA濃度和純度，OD260/280在1.9～2.0范圍內(nèi)為合格。應(yīng)用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，并以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：95 ℃10 min預(yù)變性，然后按95 ℃40s，60 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃30 s。采用2-△△Ct法對(duì)qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)一步得到在膠質(zhì)瘤組織及癌旁組織中circ_002136的表達(dá)水平。計(jì)算出circ_002136表達(dá)水平的平均值，以平均值為界將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。所用引物購自西安頂尖生物科技有限公司序列如下：circ_002136引物序列：正向：5′-CTTTCCGAGACATTTGCTGG-3′；反向：5′-CATGGAGATCACAATAAGGAACTC-3′。GAPDH引物序列：正向：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′；反向：5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0(SPSSInc,Chicago,IL,USA)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)分析膠質(zhì)瘤組織與癌旁組織circ_002136表達(dá)的差異。然后使用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，確定circ_002136表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)評(píng)價(jià)總生存率，并計(jì)算生存率差異。采用Cox比例危險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析，評(píng)估臨床病理變量及circ_002136表達(dá)水平對(duì)總生存率的影響。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Circ_002136在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)

為了確定circ_002136在膠質(zhì)瘤組織中的作用，研究通過qRT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中circ_002136的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，膠質(zhì)瘤組織中circ_002136水平顯著升高[癌旁組織(1.00±0.2449)vs膠質(zhì)瘤組織(2.967±0.3913)，P<0.01]，且高WHO分級(jí)(WHO Ⅲ-Ⅳ)和低WHO分級(jí)(WHO Ⅰ-Ⅱ)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中circ_002136水平存在顯著差異(WHOⅠ-Ⅱ，2.150±0.2918vs.WHOⅢ-Ⅳ，3.433±0.2642，P<0.01)，見圖1。

圖1 Circ_002136分別在膠質(zhì)瘤組織Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 Circ_002136表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

為確定circ_002136表達(dá)水平和膠質(zhì)瘤的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)程度，將39例組織樣本分為circ_002136低表達(dá)組(21例)和circ_002136高表達(dá)組(18例)。然后分析circ_002136的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，其中臨床病理指標(biāo)包括年齡、性別、WHO分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和腫瘤分化程度。結(jié)果表明：circ_002136的高水平表達(dá)與高WHO分級(jí)(P<0.01)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.01)密切相關(guān)，而與年齡(P>0.05)、性別(P>0.05)、腫瘤大小(P>0.05)無關(guān)(表1)。

表1 Circ_002136表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者 臨床病理指標(biāo)的相關(guān)程度(n)

2.3 高表達(dá)的circ_002136與膠質(zhì)瘤患者總生存率降低顯著相關(guān)

為了評(píng)估circ_002136的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的價(jià)值，通過對(duì)39名膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行60個(gè)月的隨訪，采用Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗(yàn)，探討circ_002136表達(dá)水平和膠質(zhì)瘤患者總生存期的相關(guān)性。生存分析的結(jié)果顯示：circ_002136高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者生存期明顯低于circ_002136低表達(dá)的患者(P<0.05)，表明circ_002136表達(dá)升高與膠質(zhì)瘤患者整體生存期縮短顯著相關(guān)(圖2)。

圖2 Circ_002136高表達(dá)組和circ_002136低表達(dá)組患者術(shù)后生存率比較

2.4 Cox回歸危險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素分析

分別采用進(jìn)行單因素和多因素分析評(píng)估circ_002136表達(dá)等臨床病理特征表達(dá)水平作為膠質(zhì)瘤預(yù)后指標(biāo)的可能性。分析發(fā)現(xiàn)，circ_002136高表達(dá)水平、高WHO分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素(表2)。

表2 膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理特征和circ_002136表達(dá)的單因素和多因素分析表

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率一直居高不下[11]。由于膠質(zhì)瘤早期癥狀隱匿，且進(jìn)展快，多數(shù)患者錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)[12]。因此研究膠質(zhì)瘤致病機(jī)制，探索膠質(zhì)瘤潛在的預(yù)后標(biāo)志物和有效治療靶點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展膠質(zhì)瘤的早期診斷和臨床治療策略具有重要醫(yī)學(xué)意義。

環(huán)狀RNA呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解，它曾經(jīng)被認(rèn)為是因外顯子轉(zhuǎn)錄本錯(cuò)誤剪接而形成的低豐度RNA分子，隨著科技的進(jìn)一步發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明circRNA是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，通過調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)節(jié)選擇性剪接和轉(zhuǎn)錄過程、作為競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)發(fā)揮miRNA海綿作用等生物功能，影響機(jī)體多種病理生理學(xué)活動(dòng)[13]。甚至有報(bào)道稱，一些circRNA通過影響腫瘤細(xì)胞基因組表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育，分化和凋亡，從而參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。同時(shí)circRNA具有成為癌癥生物標(biāo)志物的潛能，并且有望作為預(yù)后指標(biāo)。例如：在三陰性乳腺癌中，環(huán)狀RNAhsa＿circ＿0058514在組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，并有望成為臨床治療的新靶點(diǎn)[14]；環(huán)狀RNAcirc0002052在骨肉瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，可能提示骨肉瘤患者預(yù)后不良[15]；甲狀腺乳頭狀癌中，上調(diào)環(huán)狀RNAcirc_0025033通過海綿作用miR-1231和miR-1304促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[16]。最近多項(xiàng)研究表明，在膠質(zhì)瘤中也存在多種circRNA表達(dá)異常[17]，例如：circ＿0014359和hsacirc＿0037251在膠質(zhì)瘤組織表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織，且與膠質(zhì)瘤患者主要的臨床病理因素密切相關(guān)[18-19]；膠質(zhì)瘤中，circ_TTBK2過表達(dá)，敲除circ_TTBK2可抑制膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲、遷移和糖酵解[20]。作為circRNA家族中的一員，circ_002136被鑒定為一種膠質(zhì)瘤的癌基因，并且已有研究證實(shí)它在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制：circ_002136作為miR-138-5p的海綿蛋白，通過FUS/circ_002136/miR-138-5p/SOX13反饋回路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。但目前尚無關(guān)于circ_002136表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價(jià)值及臨床意義的研究，因此本研究旨在通過研究circ_002136在膠質(zhì)瘤組織及其癌旁組織中的表達(dá)，進(jìn)一步分析circ_002136表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。

研究表明，膠質(zhì)瘤組織中circ_002136明顯上調(diào)且與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。circ_002136的表達(dá)水平與WHO分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。通過分析隨訪數(shù)據(jù)，證實(shí)circ_002136高表達(dá)患者的總生存率顯著降低，提示circ_002136的上調(diào)可能是判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的有價(jià)值的標(biāo)志物。

綜上所述，在膠質(zhì)瘤中circ_002136表達(dá)明顯上調(diào)，其可作為預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后因素，為膠質(zhì)瘤的診療提供新的靶點(diǎn)。