卿明民，陳 朋，臧靜楠，祁騰達，謝政澤，尚宏麗

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

大黃花魚是我國傳統(tǒng)四大海產(chǎn)之一，其肉質(zhì)鮮美，深受廣大消費者喜愛。魚類的保鮮方法主要有低溫保藏、氣調(diào)保藏、化學(xué)和酶法保藏等，其主要機理是防止魚體接觸大量的微生物而發(fā)生腐敗變質(zhì)[1]。隨著儲藏時間的延長，魚肉中含有的不飽和脂肪酸會分解，產(chǎn)生游離脂肪酸，對其品質(zhì)和營養(yǎng)價值產(chǎn)生明顯的影響[2]。脂肪氧化后的一些產(chǎn)物又能使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化變性[3]。蛋白質(zhì)的變性會致使魚肉中蛋白的乳化性、溶解度、蛋白疏水性和凝膠性改變，導(dǎo)致其原來特有的營養(yǎng)價值損失[4]。因此，有效地抑制凍藏過程中魚肉的氧化，將對魚肉品質(zhì)的提升有著至關(guān)重要的作用。

抗氧化劑能夠明顯地抑制脂肪的氧化[5]，而化學(xué)抗氧化劑的安全性備受質(zhì)疑[6]，天然抗氧化劑是目前的主要研究方向。付麗等[7]用不同濃度的茶多酚處理凍藏牛肉丸，發(fā)現(xiàn)0.5%的茶多酚對肉丸的抗氧化效果較好。趙艷芳等[8]利用天然抗氧化劑優(yōu)化了鮐魚的儲藏加工條件。復(fù)合天然抗氧化劑的協(xié)同作用在抑制凍藏水產(chǎn)品的脂肪氧化方面效果明顯，為了全面提升凍藏大黃花魚品質(zhì)，本研究選用VE、茶多酚和異抗壞血酸鈉3 種抗氧化劑對凍藏大黃花魚進行協(xié)同作用，利用響應(yīng)面試驗優(yōu)選出復(fù)合抗氧化劑配方，用掃描電鏡對復(fù)合抗氧化劑的效果進行驗證，擬為抗氧化劑在大黃花魚冷凍儲藏加工中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

大黃花魚每條規(guī)格為：（350±50）g，購于錦州市石橋子早市；水溶性VE、茶多酚、異抗壞血酸鈉，食品級，均為河南瑞仁生物工程有限公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍法蛋白含量測定試劑盒，上海語純生物科技有限公司產(chǎn)品；2-硫代巴比妥酸、仲鉬酸銨（（NH4）6MO7O24·4H2O）、馬來酸、三磷酸腺苷二鈉（ATP）、Elon（硫酸-P甲胺酚）、濃硫酸、KH2PO4、HClO3、NaHSO3等試劑均為分析純，國藥集團試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TMS-PRO 質(zhì)構(gòu)儀，GL-21M 型高速冷凍離心機，F(xiàn)ESEM JEOL 6700F 掃描電子顯微鏡（SEM），T18 基本型分散機。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

鮮活大黃花魚放入裝有冰塊的保溫箱，迅速運到實驗室，去除魚頭、魚鱗及內(nèi)臟，用蒸餾水洗凈后切片，每片約70 g，切片厚度約8 mm，長約80 mm，寬約40 mm。將切好的魚片置于各抗氧化劑溶液中浸泡1 h，各抗氧化劑添加量見表1，將蒸餾水浸泡處理1 h的大黃花魚肉設(shè)置為對照組（CK），以自封袋分裝并迅速置于-20 ℃冰箱內(nèi)，凍藏35 d 后，取出魚片進行各項指標的測定。

表1 3 種天然抗氧化劑的添加量Table 1 Additions of three natural antioxidants

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 硬度

參考李鵬鵬等[9]的方法，在魚肉凍藏35 d 后，采樣于5 ℃的冷藏箱中，待魚肉中心溫度達到4 ℃時用質(zhì)構(gòu)儀進行硬度測定。測定參數(shù)：直徑5 mm 的通用柱形探頭P/5，下降速率3 mm/s，測試時速率1 mm/s，測試后返回速率1 mm/s，形變程度50%，測定時停留5 s，觸發(fā)力5 g。運用質(zhì)構(gòu)儀搭載的配套數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)采集。

1.2.2.2 持水性

取3 g 大黃花魚肉，稱取質(zhì)量記為m1，用雙層濾紙包裹，在4 ℃、5 000 r/min 條件下離心，稱取離心后的濾紙質(zhì)量為m2，魚肉持水性（W）[10]計算公式為：

1.2.2.3 Ca2+-ATPase 活性

參考曹淑敏等[11]的方法，并稍作修改。按表2 進行反應(yīng)體系配制，25 ℃水浴10 min，加入1 mL 15%三氯乙酸使反應(yīng)終止，將所得反應(yīng)液離心5 min（6 500 r/min，4 ℃），取上清液1mL 于試管，依次添加1.0mL 硫酸鉬酸溶液（先將70 mL 濃硫酸加入434 mL 水中制成溶液，再稱取12.5 g（NH4）6MO7O24·4H2O，0.5 mL Elon 試劑（3 g NaHSO3溶解于97 mL 水中，再加入1 g Elon 溶解），2.5 mL 蒸餾水，充分振蕩，室溫下45 min 發(fā)色后，在吸收波長640 nm 處測定吸光值A(chǔ)。然后將預(yù)先在100 ℃干燥1 h 后置于干燥器中干燥冷卻的KH2PO4用5%HClO3溶解，配成0.5 mmol/L 的溶液作標準曲線。空白組在反應(yīng)體系配制時，先加入TCA，再加入ATP 溶液，測得空白組吸光度值B。求出1 mg 蛋白質(zhì)在1 min 內(nèi)產(chǎn)生無機磷量。計算公式為：式中：X為Ca2+-ATPase 活性，μmol·（mg·min）-1；A為樣品組產(chǎn)生磷酸量，μmol；B為空白對照產(chǎn)生磷酸量，μmol；t為反應(yīng)所用時間，min；m為1 mL 反應(yīng)液所含酶的質(zhì)量，mg。

表2 Ca2+-ATPase 活性反應(yīng)體系Table 2 Reaction medium for investigating activity of Ca2+-ATPase

1.2.2.4 硫代巴比妥酸值（TBARS 值）

參考Witte 等[12]的方法，略有修改。取10 g 攪碎均勻的凍藏魚肉，加入低溫三氯乙酸溶液40 mL（質(zhì)量分數(shù)5%），均質(zhì)1 min（轉(zhuǎn)速13 800 r/min），靜置30 min，過濾，用三氯乙酸溶液（質(zhì)量分數(shù)5%）將所得濾液定容至50 mL。取5 mL 上清液于比色管，再加入5 mL 硫代巴比妥酸溶液（0.02 mol/L），封口，置于90 ℃恒溫水浴中振蕩40 min 后冷卻至室溫。以加入5 mL 蒸餾水為對照組，在538nm 處測定吸光度（A538）。

式中：A538為所測樣品吸光度；V為樣品體積，mL；M為丙二醛的分子量72.063；ε 為摩爾吸光系數(shù)156 000；1 為光程，cm；m為樣品質(zhì)量，g；1 000 為換算系數(shù)。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇茶多酚（A）、VE（B）、異抗壞血酸鈉（C）為響應(yīng)因子，以TBARS 值為響應(yīng)值，選用Design Expert 8.0 設(shè)計響應(yīng)面試驗，試驗因素水平見表3。

1.2.4 掃描電鏡分析

將每組樣品解剖縱切，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm魚背肉，樣品放入pH 7.4 的2.5%戊二醛溶液中，于4 ℃冰箱凍藏12 h，磷酸緩沖液沖洗3 次，使用1%鋨酸固定，將其置于4 ℃冰箱內(nèi)再固定2 h，再用磷酸緩沖液沖洗3 次。經(jīng)過50%～100%乙醇逐級脫水，醋酸異戊酯置換，常規(guī)臨界干燥以及真空離子鍍膜后用掃描電鏡觀察拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0 及Design Expert 8.0 和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05，每組樣品至少進行3 次平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬度變化

硬度是評價魚肉品質(zhì)的重要指標，硬度過低會導(dǎo)致魚肉口感不佳。由圖1 可知，茶多酚添加量0.4%時，魚肉硬度顯著高于VE 和異抗壞血酸鈉處理組（P＜0.05），說明茶多酚能夠有效抑制在冷凍環(huán)境下魚肉硬度的下降，這可能是因為茶多酚所含的多羥基結(jié)構(gòu)阻礙魚肉脂肪氧化，進而延緩肌原纖維蛋白的變性，但隨后魚肉硬度呈下降趨勢，表明茶多酚在一定條件下會起到促氧化作用，這與Jongberg 等[13]研究發(fā)現(xiàn)綠茶提取物在巰基氧化生成二硫鍵中有促氧化作用一致。隨著VE 添加量增加，魚肉硬度增長緩慢；而隨著異抗壞血酸鈉添加量的增加，魚肉硬度增長不顯著。

圖1 不同添加量的抗氧化劑與大黃花魚片硬度的關(guān)系Fig.1 Relationships between different concentrations of antioxidants and hardnesses of Larimichthys croceas fillets

2.2 持水性變化

由圖2 可見，茶多酚添加量為0.4%時，魚肉持水性最佳，且顯著高于對照組（P＜0.05），研究者Siddaiah等[14]和Farouk 等[15]指出魚肉持水性的下降是由于蛋白質(zhì)變性促使肌球蛋白和肌動蛋白結(jié)合增加，進而導(dǎo)致持水性下降，添加茶多酚后持水性有所提升，原因可能是茶多酚通過阻礙脂肪氧化來降低蛋白質(zhì)變性程度，但添加量大于0.4%時，對應(yīng)魚肉持水性呈下降趨勢，表明茶多酚的添加需要有一定限度。VE 添加量0.6%時的持水性與對照組差異不顯著，VE 對持水性的提升作用可能與其對細胞膜修復(fù)作用有關(guān)。異抗壞血酸鈉添加量為0.3%時，魚肉持水性顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖2 不同添加量的抗氧化劑與大黃花魚片持水性的關(guān)系Fig.2 Relationships between different concentrations of antioxidants and water holding capacities of Larimichthys croceas fillets

2.3 Ca2+-ATPase 活性變化

由圖3 可知，茶多酚添加量為0.2%時，Ca2+-ATPase活性顯著高于對照組（P＜0.05），茶多酚添加量為0.4%時，Ca2+-ATPase 活性最高，其活性越低則魚肉中肌原纖維蛋白的變性程度就越大[16]，相關(guān)研究指出茶多酚在適宜濃度下能抑制黃花魚片脂肪氧化[17]，但隨后曲線開始下降，其原因可能是高濃度茶多酚對蛋白酶起到一定抑制作用[18]，降低了魚肉的Ca2+-ATPase活性。VE 添加量為0.3%時，Ca2+-ATPase 活性顯著高于對照組（P＜0.05），隨后上升趨勢變緩，Saeed 等[19]將一定量的VE 加入到碎魚肉中，發(fā)現(xiàn)其可提高魚肉的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性，但VE 添加量為0.2%時的Ca2+-ATPase 活性與對照組酶活相比無顯著差異，可能是因為低濃度的VE 抑制脂肪氧化能力不強，導(dǎo)致脂肪氧化產(chǎn)物與肌原纖維蛋白之間作用未被有效阻止，蛋白變性程度繼續(xù)增大，Ca2+-ATPase 活性降低。異抗壞血酸鈉添加量為0.6%時，魚肉的Ca2+-ATPase 活性最大，且顯著高于對照組（P＜0.05）。陳洪生等[20]認為，異抗壞血酸鈉的抗氧化作用很強，可通過有效抑制脂肪氧化，減少脂肪氧化產(chǎn)物對肌原纖維蛋白產(chǎn)生的影響，從而提高Ca2+-ATPase 活性。

2.4 TBARS 值變化

由圖4 可見，隨著茶多酚添加量的增加，對應(yīng)曲線呈現(xiàn)先迅速下降后緩慢上升的趨勢，在添加量為0.4%時，魚肉TBARS 值顯著低于對照組（P＜0.05），可能是因為茶多酚清除多元不飽和脂肪酸自由基、單線態(tài)氧[21-23]，阻礙脂肪氧化所發(fā)生的鏈式反應(yīng)，達到抗氧化作用，隨后曲線上升趨勢變緩，可能是因為茶多酚添加量過高對于某些抑制脂肪氧化的反應(yīng)起到了反作用，導(dǎo)致抗氧化效果下降。VE 添加量為0.3%時，魚肉的TBARS 值顯著低于對照組（P＜0.05），但添加量0.3%～0.6%之間無顯著差異。異抗壞血酸鈉添加量為0.4%時，魚肉的TBARS 值顯著低于添加量為0.2%時的TBARS 值（P＜0.05），但添加量大于0.3%的各組之間無顯著差異，說明異抗壞血酸鈉為0.4%時，即能起到有效的抗氧化作用。

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面法對復(fù)合抗氧化劑配比進行優(yōu)化，試驗方案及結(jié)果見表4。

2.5.2 回歸模型的建立及方差分析

對表4 中的數(shù)據(jù)完成多元線性回歸擬合，得到凍藏期間大黃花魚片TBARS 值與各天然抗氧化劑用量的二次多項回歸方程為：

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Response surface experimental design and results

系數(shù)絕對值的大小表示各響應(yīng)因素對響應(yīng)值TBARS 值的影響程度，其正、負代表影響方向[24]，該多元線性回歸方程的方差分析見表5。

表5 響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表5 可知，模型項P值為0.001 2，小于0.01，說明該試驗選用的模型極顯著，方差的擬失項P值為0.107 2，大于0.05，不顯著，表明回歸模型擬合較好，該模型可用于試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析，R2=0.999 8，說明該模型的預(yù)測值與實測值之間有較好的相關(guān)性[25]。3 個因素中一次項A、C及二次項C2對響應(yīng)值（TBARS 值）影響達極顯著水平（P＜0.01）；一次項B、二次項B2及交互項AB、AC、BC對響應(yīng)值（TBARS 值）的影響達顯著水平（P＜0.05）；A2項對響應(yīng)值影響不顯著。這說明茶多酚、VE 及異抗壞血酸鈉用量均顯著影響凍藏大黃花魚的TBARS 值。由F值可得，各因素對TBARS 值影響的主次順序為：茶多酚＞異抗壞血酸鈉＞VE，茶多酚與VE、茶多酚與異抗壞血酸鈉、VE 與異抗壞血酸鈉之間均存在協(xié)同增效作用，它們對TBARS 值的影響主次順序為：茶多酚×VE＞茶多酚×異抗壞血酸鈉＞VE×異抗壞血酸鈉。

2.5.3 因素間的交互作用分析

為進一步研究各因素間的協(xié)同作用，通過回歸方程來繪制茶多酚、VE、異抗壞血酸鈉對TBARS 值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖（圖5）。陡峭的響應(yīng)曲面圖代表響應(yīng)值很大程度上受該因素的影響，反之影響不大[26]，呈橢圓形的等高線圖代表兩個因素之間的相互作用強，反之則弱[27]。如圖5 所示，從響應(yīng)面圖可以直觀看出茶多酚對大黃花魚的TBARS 值影響最大，其次是異抗壞血酸鈉，VE 的影響最?。? 個等高線圖均呈現(xiàn)一定程度的橢圓形，圖5a2中等高線的橢圓形狀最明顯，表明茶多酚與VE 之間存在明顯的交互效應(yīng)；圖5b2中等高線形狀也呈橢圓，雖橢圓形狀較圖5a2弱一些，但也表明茶多酚與異抗壞血酸鈉之間有明顯的交互作用；圖5c2中等高線呈現(xiàn)完整橢圓形，表明VE 與異抗壞血酸鈉之間也存在交互作用?？梢姴瓒喾?、VE、異抗壞血酸鈉3 種天然抗氧化劑兩兩之間存在交互作用，如將三者復(fù)合將對魚肉品質(zhì)提升有更優(yōu)效果。

圖5 各因素間的交互作用對大黃花魚片TBARS 值影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface graphs and contour maps showing the interactive effects of various factors on TBARS values of Larimichthys croceas fillets

2.5.4 復(fù)合抗氧化劑配比優(yōu)化及驗證性試驗

根據(jù)回歸模型分析可知，TBARS 值為0.0595mg/kg工藝最優(yōu)條件為：茶多酚添加量0.40%，VE 添加量0.29%，異抗壞血酸鈉添加量0.30%，做3 次平行試驗TBARS 值為0.061 3 mg/kg，與理論值0.059 5 mg/kg接近。說明該模型能較好地預(yù)測實際TBARS 值。

2.6 掃描電鏡結(jié)果分析

大黃花魚在凍藏過程中表面三維結(jié)構(gòu)的變化可以利用具有高分辨率掃描電子顯微鏡觀察，其中魚肉肌肉纖維結(jié)構(gòu)變化是掃描電鏡使用電子束掃描魚肉樣品的檢測指標。如圖6a 所示，新鮮大黃花魚背肉的組織結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡觀察，肌肉排列整齊，肌肉組織保持明顯和均勻的明暗相間的條紋結(jié)構(gòu)，肌漿網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，說明新鮮魚肉的肌肉質(zhì)地非常好，組織結(jié)構(gòu)完整，未受到任何損傷。如圖6b 所示，未添加抗氧化劑的凍藏35 d 的大黃花魚組織結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡觀察可以看到，大黃花魚背肉肌肉排列雜亂無章，肌肉組織明暗相間的條紋結(jié)構(gòu)徹底消失，這說明未添加抗氧化劑凍藏35 d 的大黃花魚肌肉組織結(jié)構(gòu)受到了嚴重的破壞和損傷。如圖6c 所示，添加最優(yōu)組合抗氧化劑的凍藏35 d 的大黃花魚組織結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡觀察可以看到，大黃花魚背肉肌肉排列只有較小的變化，肌肉組織依然保持著較均勻的明暗相間的條紋結(jié)構(gòu)，這說明添加了最優(yōu)組合抗氧化劑的凍藏大黃花魚肉組織結(jié)構(gòu)只受到了較少破壞，復(fù)合抗氧化劑對凍藏大黃花魚具有很好的保護效果，抑制了魚肉品質(zhì)變壞，對冷凍魚肉的氧化變性起到了積極的抵抗作用。

圖6 各組黃花魚樣品掃描電鏡結(jié)果Fig.6 Scanning electron microscopy results of Larimichthys croceas in each group

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定茶多酚、VE 及異抗壞血酸鈉的較優(yōu)抗氧化濃度范圍，在所選濃度范圍中，以TBARS 值為響應(yīng)值，對茶多酚、VE、異抗壞血酸鈉進行響應(yīng)面法優(yōu)化抗氧化劑的復(fù)配，得到最優(yōu)復(fù)合抗氧化劑配方為：茶多酚添加量0.40%，VE 添加量0.29%，異抗壞血酸鈉添加量0.30%，此時TBARS 值為0.061 3 mg/kg。利用掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)，大黃花魚肉用該復(fù)合抗氧化劑溶液浸漬處理后，能明顯減少其因凍藏引發(fā)的肌肉纖維結(jié)構(gòu)損壞，且能有效抑制其因脂肪氧化引發(fā)的組織損傷，表明該復(fù)合抗氧化劑能有效提升大黃花魚凍藏品質(zhì)。