賀濛初，李思婷，王 志，舒迎霜，桂雪兒，朱 杰，李錦春，吳金節(jié)

(1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥230036；2宣城市木子禽業(yè)專業(yè)合作社，安徽 宣城 242000)

腸道疾病為雛雞的常見多發(fā)病[1]，目前預(yù)防雛雞腸道感染的主要措施是在飼料飲水中添加抗生素。隨著我國對畜禽飼料飲水中添加促生長類抗生素的限制，“減抗”、“替抗”產(chǎn)品的研發(fā)迫在眉睫。益生菌作為最常用的微生態(tài)制劑，具有無毒、無耐藥性、無殘留、提高機(jī)體免疫力、預(yù)防雞消化道疾病等特點(diǎn)[2]，單一的益生菌如乳酸桿菌Lactobacillus、芽孢桿菌Bacillus subtilis對雞腹瀉有較好的預(yù)防作用，而復(fù)合益生菌能更好地防治腸道感染[3]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一類I型跨膜糖蛋白模式識(shí)別受體，TLR 在家禽各個(gè)器官中都參與抗病原菌感染作用，其中TLR2和TLR4分別起到識(shí)別革蘭陽性菌的肽聚糖和革蘭陰性菌的脂多糖的作用[4]，并通過影響下游的Myd88依賴通路[5]，改變TRAF-6和AP-1蛋白的表達(dá)，影響血清中免疫球蛋白的含量[6]。而血清中的IgG、IgM作為非特異性免疫的重要一環(huán)，對于識(shí)別和清除體內(nèi)外來抗原具有重要作用[7]，血清中IgG、IgM水平的適度上升代表著機(jī)體對病原抵抗力的上升[8]。

本試驗(yàn)在1日齡雛雞飼料中添加乳酸菌與芽孢桿菌，觀察添加益生菌對雛雞血清中免疫球蛋白和腸道組織中TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6、AP-1等Toll樣受體通路蛋白表達(dá)的影響，探究飼料中添加益生菌對雞腸道Toll 樣受體通路及其下游免疫因子的調(diào)控作用，研究益生菌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：MRS肉湯及瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯及瓊脂培養(yǎng)基購自杭州百思生物科技有限公司，生理鹽水、磷酸、氫氧化鈉、多聚甲醛、無水乙醇、異丙醇購自無錫展望化工有限公司，DEPC水購自MDL 公司，細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自南京擎科生物公司，ELISA 試劑盒購自上海源葉生物有限公司，UltraPure Agarose、SuperScript ⅢRT反轉(zhuǎn)錄kit 和Sybrqpcr mix 購自ABI-invitrogen公司。

儀器：MIC-4 qPCR 儀購自BMS公司，微量移液器購自Eppendorf 公司，TGL-18R 臺(tái)式高速離心機(jī)購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，超凈工作臺(tái)購自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司，電泳儀、凝膠成像儀購自Biorad 公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

分離益生菌和試驗(yàn)用雞均由安徽宣城市木子禽業(yè)專業(yè)合作社提供。試驗(yàn)用雞為1日齡白羽肉雜雞。90只雛雞隨機(jī)分為3組，分別為對照組、益生菌低劑量組和益生菌高劑量組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。其中，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧（表1），低劑量組在每千克基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合益生菌109cfu，高劑量組在每千克基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合益生菌2×109cfu。

1.3 益生菌分離鑒定

分別選取7、14、28日齡健康雞，剖檢后無菌采集十二指腸和空腸內(nèi)容物。

乳酸菌分離：將1 g 新鮮腸道內(nèi)容物用生理鹽水進(jìn)行10?4、10?5、10?6梯度稀釋，并分別滴加到含0.75%(w)CaCO3的MRS固體選擇培養(yǎng)基上，涂布均勻。把培養(yǎng)基小心裝入?yún)捬豕?，放?7℃的恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察待檢菌落的形成、發(fā)育和溶鈣環(huán)的大小。挑取有明顯溶鈣環(huán)的單個(gè)菌，在MRS選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。再次接種培養(yǎng)，直到形成形態(tài)均一、分布均勻的單一菌落為止[9]。

表 1基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levelsof basal diets(air-dry basis)

芽孢桿菌分離[10]：將1 g 新鮮腸道內(nèi)容物用生理鹽水進(jìn)行10?4、10?5、10?6梯度稀釋，并分別取100 μL涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。鏡檢培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落。挑取芽孢桿菌單菌落在普通營養(yǎng)瓊脂平板上畫線培養(yǎng)，每個(gè)單菌落平板畫線重復(fù)2～3次，得到純的芽孢桿菌。將芽孢桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，保存?zhèn)溆?。分離的菌株純化擴(kuò)增后，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書上的方法，提取細(xì)菌的基因組DNA，并送往南京擎科生物公司測序鑒定菌株。

1.4 免疫球蛋白ELISA 檢測

分別選取7、14、21日齡雞，翅靜脈采血，分離血清，?20℃保存。按照ELISA 試劑盒詳細(xì)步驟要求，檢測血清IgG、IgM含量。

1.5 免疫組織化學(xué)(IHC)法檢測腸道通路蛋白

每組隨機(jī)選取10只21日齡雞放血致死，采取十二指腸，保存于體積分?jǐn)?shù)為20%的多聚甲醛溶液中，制成蠟塊并切片。采用IHC方法，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的三步法進(jìn)行檢測。設(shè)置陰性對照，一抗分別為TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6、AP-1的特異性單克隆抗體，二抗為生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG 抗體。染色后在200倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，同一視野重復(fù)3次，并將所拍圖像在Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)上進(jìn)行光密度值分析。

1.6 RT-q PCR 法檢測十二指腸Toll 樣受體通路蛋白的mRNA 相對表達(dá)量

Trizol 法提取雞十二指腸組織中的RNA，使用分光光度計(jì)檢測RNA 純度，之后反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行qPCR 檢測，qPCR 反應(yīng)體系為20μL：模板2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，qPCR MIX 10μL，dd H2O 7μL。qPCR 反應(yīng)引物(表2)由南京擎科公司合成[11]。

1.7 Western blot 法檢測Toll 樣受體通路蛋白表達(dá)量

將各組雞十二指腸在冰上研磨，加入混有蛋白酶抑制劑以及蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，漩渦振蕩器混合均勻，置于冰上20 min 使細(xì)胞充分裂解。13000 r/min 離心10 min，收集上清液。按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白濃度。將提取的蛋白質(zhì)樣品煮沸5 min，在SDS-PAGE 凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用牛血清白蛋白(Bull serum albumin，BSA)在室溫下封閉膜4 h 后，放入一抗，在4℃條件下孵育過夜。將膜洗滌3次，并用二抗在室溫下水平振蕩孵育45 min，洗膜后放入凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)中成像。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，運(yùn)用數(shù)據(jù)軟件GraphPad Prism7.0進(jìn)行柱狀圖的繪制。Westernblot 結(jié)果采用AlphaEase FC軟件進(jìn)行灰度值分析。

表 2 qPCR 引物參數(shù)Table 2 qPCR primer parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌菌株與性質(zhì)

經(jīng)測序鑒定，所分離出的菌株是動(dòng)物乳酸桿菌BNCC134981和蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereusVP11。將2種細(xì)菌分別在發(fā)酵罐中培養(yǎng)至108cfu / mL，然后凍干成干粉。干粉中的活細(xì)菌量為1012cfu / g，并且2種細(xì)菌以1∶1的質(zhì)量比混合，直接添加到日糧中并攪拌均勻。

2.2 白羽肉雜雞料肉比變化

由表3可知，第7天時(shí)，益生菌高劑量組雞平均體質(zhì)量和平均日采食量分別比對照組高12%和10%(P＜0.05)，分別比益生菌低劑量組高11%和10%(P＜0.05)。各組間料肉比差異不顯著。第14天時(shí)，益生菌低劑量組和高劑量組平均體質(zhì)量分別比對照組高8%和11%(P＜0.05)，各組間平均日采食量差異不顯著；益生菌低劑量組和高劑量組料肉比分別比對照組低6%和8%(P＜0.05)。第21天時(shí)，益生菌低劑量組和高劑量組雞平均體質(zhì)量分別比對照組高8%和12%(P＜0.01)，益生菌高劑量組平均體質(zhì)量比益生菌低劑量組高4%(P＜0.05)，各組間平均日采食量差異不顯著；益生菌低劑量組與高劑量組料肉比分別比對照組低9%和12%(P＜0.01)。

表 3益生菌對雞生長性能的影響1)Table 3 Effect of probioticson growth performance of chicks

2.3 雞血清免疫球蛋白IgG 與IgM 含量的變化

由表4可知，第7天時(shí)，各組間IgG、IgM 含量差異不顯著。第14天時(shí)，益生菌低劑量組血清IgG、IgM含量分別比對照組高21%(P＞0.05)和23%(P＜0.05)，益生菌高劑量組血清IgG、IgM含量分別比對照組高28%和44%(P＜0.01)，益生菌高劑量組血清Ig G、Ig M含量顯著高于益生菌低劑量組(P＜0.01)。第21天時(shí)，益生菌低劑量組血清IgG、IgM 含量分別比對照組高28%和44%(P＜0.01)，益生菌高劑量組血清IgG、IgM含量分別比對照組高40%和58%(P＜0.01)，益生菌低劑量組與高劑量組相比差異不顯著。

表4 益生菌對雞血清IgG 和IgM 含量的影響1)Table 4 Effect of probiotics on IgG and IgM contents in chicken serumρ/(μg·mL?1)

2.4 腸道通路蛋白分布

IHC 檢測結(jié)果見圖1。由圖1 可見，TLR2、TLR4、Myd88、AP-1、TRAF-6蛋白皆在十二指腸中表達(dá)，其主要表達(dá)區(qū)域?yàn)槟c絨毛外側(cè)與腸壁細(xì)胞中。

圖1 雞十二指腸Toll 樣受體通路蛋白的免疫組化圖Fig.1 Immunohistochemical photographsof Toll-likereceptor pathway proteinsin duodenum of chicks

由圖2可知，益生菌低劑量組十二指腸TLR4、AP-1蛋白光密度均比對照組高28%(P＜0.01)。益生菌高劑量組十二指腸TLR2、TLR4、AP-1和TRAF-6蛋白光密度分別比對照組高36%、41%、61%和39%(P＜0.01)。益生菌高劑量組十二指腸5種蛋白的光密度均顯著高于益生菌低劑量組(P＜0.05)。

圖2 益生菌對Toll 樣受體通路蛋白光密度的影響Fig.2 Effect of probioticson optical density of Toll-like receptor pathway protein

2.5 腸組織通路蛋白mRNA 相對表達(dá)量

圖3 益生菌對Toll 樣受體通路蛋白mRNA 相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of probiotics on themRNA relativeexpression of Toll-likereceptor pathway protein

如圖3所示，與對照組相比，益生菌低劑量組十二指腸TLR4、AP-1的mRNA 相對表達(dá)量升高28%和67%(P＜0.01)，益生菌高劑量組十二指腸TLR4、AP-1的mRNA 相對表達(dá)量升高69%和98%(P＜0.01)。益生菌高劑量組十二指腸AP-1、TLR2、TLR4的mRNA 相對表達(dá)量顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于益生菌低劑量組。

2.6 腸組織通路蛋白表達(dá)量

由圖4、5可知，與對照組相比，益生菌低劑量組十二指腸TLR2蛋白表達(dá)量升高21%(P＜0.05)，TLR4、AP-1、TRAF-6和Myd88蛋白表達(dá)量分別升高33%、106%、56%和45%(P＜0.01)，益生菌高劑量組十二指腸TLR2、TLR4、AP-1、TRAF-6和Myd88蛋白表達(dá)量分別升高60%、106%、163%、121%和72%(P＜0.01)。益生菌高劑量組十二指腸5種蛋白的表達(dá)量均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于益生菌低劑量組。

圖4 Toll 樣受體通路蛋白的電泳圖Fig.4 Electr op hor etic p atter n of Toll-lik e r ecep tor pathway protein

圖5 益生菌對Toll 樣受體通路蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of probiotics on the expression level of Toll-like receptor pathway protein

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加益生菌可降低肉雞飼養(yǎng)的料肉比，且益生菌高劑量組與益生菌低劑量組差異不顯著。有研究顯示，在飼料中添加芽孢桿菌、乳酸菌、丁酸梭菌等益生菌可提高肉雞生產(chǎn)性能，包括增加日采食量、減少料肉比、提高體質(zhì)量等[12-13]。其主要作用為改善腸道健康，以增強(qiáng)對飼料的吸收[2,12]。

王佳麗等[3]通過體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，在飼料中添加益生菌可顯著提高肉雞血清中免疫球蛋白含量。唐志剛等[14]研究發(fā)現(xiàn)添加益生菌可提高肉雞胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)，且血清IgG、IgM、IgA 含量隨之升高，以此增強(qiáng)肉雞機(jī)體免疫能力。本試驗(yàn)在飼喂第14天時(shí)，益生菌高劑量組血清免疫球蛋白含量顯著高于益生菌低劑量組，表明高劑量的益生菌在短期提高機(jī)體免疫力方面有更好的效果；而飼喂第21天時(shí)，益生菌高劑量組血清免疫球蛋白含量與益生菌低劑量組差異不顯著，表明大劑量的益生菌可以使雛雞體內(nèi)免疫球蛋白更快地達(dá)到正常雛雞的峰值，且不會(huì)突破峰值引起炎癥反應(yīng)。

Zhou 等[15]研究表明，飼喂黃芪多糖可調(diào)節(jié)TLR4受體通路，并增加Myd88依賴的信號(hào)通路表達(dá)。Myd88依賴通路通過調(diào)節(jié)下游蛋白TRAF-6、AP-1的表達(dá)來參與機(jī)體多項(xiàng)免疫反應(yīng)[16]。本試驗(yàn)中，在飼料中添加益生菌后，益生菌低劑量組與高劑量組雞腸道TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6和AP-1蛋白的表達(dá)量和mRNA 相對表達(dá)量顯著或極顯著升高，且隨著益生菌劑量的增加，通路蛋白及其基因的表達(dá)量也隨之上升，表明添加益生菌對雛雞腸道TLR2、TLR4通路及相關(guān)蛋白有上調(diào)作用。本試驗(yàn)中，血清中IgG、IgM 含量隨著添加益生菌劑量增加而升高，且其變化趨勢與TLR2表達(dá)相一致，表明TLR2受體蛋白的表達(dá)與IgG 等免疫球蛋白分泌正相關(guān)。在炎癥模型中，中藥、益生菌等抗生素替代品主要作用為抑制炎癥通路，從而減少炎癥因子分泌，減輕炎癥反應(yīng)。劉瑞等[17]研究證明，在雛雞模型中，因雛雞免疫器官未發(fā)育完全，體內(nèi)免疫因子含量低于正常水平，因此使用黃芪多糖等可促使免疫器官發(fā)育，提高Toll樣受體通路蛋白含量，這與本研究結(jié)果一致。

大量研究報(bào)道，飼料中添加益生菌可增加雞的免疫力和生長性能[18-19]，但是對于益生菌對Toll 樣受體信號(hào)表達(dá)的研究，主要還停留在小鼠模型和細(xì)胞層面。本研究通過體內(nèi)試驗(yàn)，證實(shí)益生菌可改善腸道內(nèi)TLR2和TLR4介導(dǎo)的Toll 樣受體通路蛋白表達(dá)，增加血清中IgG、IgM 的含量。但Toll樣受體通路蛋白表達(dá)與血清中免疫球蛋白含量是否有直接關(guān)聯(lián)作用，需進(jìn)一步研究。

綜上，飼料中添加益生菌能有效降低白羽肉雜雞仔雞料肉比，提高血清中IgG、IgM 含量，通過正向調(diào)控仔雞體內(nèi)TLR2與TLR4通路表達(dá)及相關(guān)蛋白含量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。