林惠嬌，牟桂萍，滕少娜，張海鵬，周而勛

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642；2黃埔海關(guān)，廣東廣州510730；3重慶海關(guān)，重慶401147)

蘋果殼色單隔孢潰瘍病(Diplodiacanker)的病原菌為史蒂芬葡萄座腔菌Botryosphaeria stevensii，異名Physalospora mutila，無性態(tài)Diplodia mutila[1-2]，是我國禁止入境的重要檢疫性有害生物[3]。其寄主范圍非常廣泛，可為害蘋果Malusspp.、梨Pyrusspp.、李Prunusspp.、葡萄Vitisspp.、櫟Quercusspp.、棕櫚Trachycarpusspp.等多達(dá)11科18屬的重要經(jīng)濟(jì)植物[4]。根據(jù)國際應(yīng)用生物科學(xué)中心(https://www.cabi.org/cpc)公布的相關(guān)信息，目前蘋果殼色單隔孢潰瘍病分布的國家有美國、加拿大、秘魯、澳大利亞、新西蘭、智利、意大利、西班牙、德國、法國、英國、波蘭、摩洛哥、匈牙利、葡萄牙、保加利亞、南非、印度等，在我國無分布[5]。該病菌可引起蘋果和梨重要的枝干和果實(shí)病害，主要導(dǎo)致葉片黃化枯萎，引起枝干潰瘍干枯，還可引起果實(shí)腐爛，在其他闊葉樹上也可引起類似的癥狀[1,6]。病菌分生孢子在生長季節(jié)可通過風(fēng)雨或昆蟲傳播[7]，也可隨原木、苗木及果實(shí)的調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[8]。該病菌通過貿(mào)易進(jìn)行跨國異地傳播的風(fēng)險(xiǎn)極高，一旦傳入將對(duì)我國水果產(chǎn)業(yè)造成很大的威脅。

準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行物種鑒定是防止外來有害生物入侵的首要環(huán)節(jié)。由于葡萄座腔菌屬Botryosphaeria真菌的有性態(tài)在自然環(huán)境和培養(yǎng)條件下都很難產(chǎn)生，而其無性態(tài)的形態(tài)特征多有重疊且不穩(wěn)定，因此該屬的形態(tài)分類鑒定十分困難[9-11]。通過核糖體DNA 序列的分析比較進(jìn)行種類鑒定已被廣泛應(yīng)用于這一真菌類群[2,12-14]。此外，RAPD[15-16]、ISSR[17-18]、ARDRA[19]、RFLP[20-21]、SSCP[22]、RAMS[23]、MSPPCR 和rep-PCR[24]等DNA 指紋圖譜技術(shù)也被應(yīng)用于該類真菌的分類研究。針對(duì)葡萄座腔菌屬真菌特定類群的特異性檢測技術(shù)也有相關(guān)研究[25-29]。但目前國內(nèi)外鮮見針對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 特異性檢測的報(bào)道。

本研究根據(jù)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌的β微管蛋白(β-tubulin)基因保守序列，設(shè)計(jì)篩選特異引物及探針，旨在建立針對(duì)該病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測技術(shù)，為口岸的植物檢驗(yàn)檢疫提供一種靈敏而高效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株包括蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌及其近緣種屬、水果上常見的病原菌27株。來源于荷蘭微生物菌種保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures,CBS)、中國林業(yè)微生物保藏管理中心(China Forestry Culture Collection Center,CFCC)和中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China,ACCC)等標(biāo)準(zhǔn)菌種庫，以及海關(guān)從入境貨物中分離保存的菌種。供試菌株來源、寄主等相關(guān)信息見表1。

1.2 菌絲體培養(yǎng)及DNA 提取

供試菌株接種于PDA 平板于24℃條件下光暗交替培養(yǎng)7～10 d，待菌落長到直徑5～6 cm 時(shí)，收集菌絲，加液氮研磨后，采用TIANGEN DP320植物基因組DNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組DNA，用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀(Thermo Fisher Scientific, USA)測定DNA 的濃度和純度，并于?20 ℃條件下保存。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)

基于前期獲得的蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌及其近緣種的β微管蛋白基因(β-tubulin基因)序列，以Primer Express 3.0(Thermo Fisher Scientific,USA)和Beacon Designer 7.5(Premier Biosoft Company,Canada)軟件輔助設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR 引物和特異性探針，其中，引物BsF1:5′-CGGACGA GACCTTCTGTATTGAC-3′和BsR1：5′-GCTC GAACCAGCCGACTAAG-3′，探針BsP267：FAMCGAGGTACGTGAAATT-MGB。引物及探針委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。并將其輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫中運(yùn)用Primer-BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)及特異性檢驗(yàn)。

1.4 陽性質(zhì)粒構(gòu)建

將蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌β-tubulin基因靶標(biāo)序列片段轉(zhuǎn)入含有氨芐卡那霉素(Ampicillin,Amp)抗性的pUC57載體上，得到蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌β-tubulin基因重組陽性質(zhì)粒，將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Escherichia coliDH5α 后用甘油在?80℃條件下保存。

表1 本研究供試菌株的相關(guān)信息Table1 Information of strainsused in thestudy

1.5 特異性測試

以蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌及其近緣種標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA 為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 的特異性檢測。PCR 試劑均購自東洋紡(上海)生物科技有限公司(TOYOBO)。PCR 反應(yīng)體系為20μL，包括10μL 2×Thunderbird Probe qPCR Mix(含1×ROX reference dye)，上、下游引物(10μmol/L)和探針(10 μmol/L)各0.4μL，1μL 模板DNA，加無菌水補(bǔ)至20μL。在ABIStep One Plus實(shí)時(shí)熒光PCR 儀上設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性60 s；95℃15 s，64℃36 s，循環(huán)40次。以無菌水為空白對(duì)照，以循環(huán)閾值CT≤35作為陽性標(biāo)準(zhǔn)閾值。

1.6 靈敏度測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以帶有蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌β-tubulin基因靶標(biāo)序列的重組陽性質(zhì)粒pUC-BsBTU 為模板，對(duì)TaqMan 探針BsP267進(jìn)行熒光PCR 靈敏度測試。對(duì)質(zhì)粒DNA 進(jìn)行系列稀釋，得到DNA 質(zhì)量濃度為100 000、10 000、1 000、100、10、1、0.1 fg/μL 的系列稀釋液，各取1μL作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序同“1.5”。以無菌水為空白對(duì)照，以CT≤35作為陽性標(biāo)準(zhǔn)閾值。以模板量的對(duì)數(shù)值與所得CT 值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性質(zhì)粒的構(gòu)建

將蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌β-tubulin基因包含BsF1、BsP267和BsR1序列的400 bp片段(圖1)插入到pUC57載體上，構(gòu)建蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌β-tubulin基因重組質(zhì)粒，該陽性質(zhì)粒命名為pUC-BsBTU。

2.2 特異性測試

采用引物BsF1/BsR1和探針BsP267對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌及其近緣種標(biāo)準(zhǔn)菌株以及從水果分離的常見病原真菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測，結(jié)果(圖2)顯示，探針BsP267分別對(duì)供試3株蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌目標(biāo)菌株表現(xiàn)出特異性陽性擴(kuò)增，熒光信號(hào)明顯增加，而非目標(biāo)菌株以及空白對(duì)照都沒有檢測到熒光信號(hào)，表現(xiàn)為陰性。結(jié)果表明本研究建立的蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法特異性良好。

圖1 靶標(biāo)基因陽性質(zhì)粒克隆序列Fig.1 Cloning sequence of positive plasmid of target gene

圖2 探針BsP267對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌的特異性檢測Fig.2 Specificity idendification of Botryosphaeria stevensii using probe BsP267

2.3 靈敏度測試

采用探針BsP267對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌菌株的重組陽性質(zhì)粒DNA 不同稀釋度模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測。結(jié)果(圖3)顯示：質(zhì)量濃度為100 000、10 000、1 000、100、10、1 fg/μL 的陽性質(zhì)粒DNA 都能檢測到明顯的熒光信號(hào)，表現(xiàn)為陽性擴(kuò)增；0.1fg/μL的陽性質(zhì)粒DNA 的CT值為37.01，超過了35這一陽性標(biāo)準(zhǔn)閾值，這表明BsP267探針對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌陽性質(zhì)粒DNA 的檢測靈敏度可達(dá)到1 fg/μL。

圖3 探針BsP267對(duì)陽性質(zhì)粒DNA 的靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity idendification of positive plasmid DNA using probe BsP267

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

將蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌菌株的重組陽性質(zhì)粒DNA，分別稀釋至100 000、10 000、1 000、100、10、1、0.1 fg/μL 7個(gè)質(zhì)量濃度梯度后，熒光定量PCR 并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4 所示，CT 值為17.37～37.01，線性回歸方程為：y=?3.189lgx+36.692，決定系數(shù)(R2)為0.993(參考值＞0.95)，擴(kuò)增效率為105.858%(參考值范圍為90%～110%)，結(jié)果表明其線性相關(guān)性良好、擴(kuò)增效率高、滿足可信度要求，該方法可應(yīng)用于蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌的特異性檢測。

圖4 實(shí)時(shí)熒光PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Real-time fluorescent PCR standard curve

3 結(jié)論與討論

開發(fā)適用于口岸植物檢疫的快速診斷技術(shù)，對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，對(duì)防止該類病原菌的傳入至關(guān)重要。前期研究中，對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌的翻譯延長因子基因(EF-1α)、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因(ITS)、RNA 聚合酶II第2亞基基因(RPB2)、谷氨酰胺合成酶基因(GS)和核糖體大亞基(LSU)等基因序列進(jìn)行了特異性引物和探針篩選，最后基于特異性和擴(kuò)增效率，確定了β-tubulin基因作為蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌特異性檢測的靶標(biāo)基因。β-tubulin基因在細(xì)胞生長過程中有著重要作用，其序列具有高度的保守性，具有管家基因的特性[30]。此外，該基因既有保守的外顯子又有許多可變的內(nèi)含子，在不同屬、種間蘊(yùn)含著豐富的變異，常作為標(biāo)識(shí)片段用于真菌的物種鑒定[31-35]。

本研究使用TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測殼色單隔孢潰瘍病菌。通過大量文獻(xiàn)分析及對(duì)前期基礎(chǔ)研究的總結(jié)，選擇蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌特異性高、保守性強(qiáng)的β-tubulin基因作為檢測靶標(biāo)。引物BsF1/BsR1和探針BsP267組合對(duì)蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌及其近緣種標(biāo)準(zhǔn)菌株以及從水果分離的常見病原真菌的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測結(jié)果顯示，探針BsP267對(duì)供試陽性菌株均表現(xiàn)出特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增效率為105.858%，最低檢測DNA 質(zhì)量濃度下限為1 fg/μL；而非目標(biāo)菌株以及空白對(duì)照都沒有檢測到特異性擴(kuò)增。結(jié)果表明本研究建立的蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法特異性良好，所設(shè)計(jì)的引物BsF1/BsR1和特異性探針BsP267可對(duì)未知樣品進(jìn)行殼色單隔孢潰瘍病菌的特異檢測。引物和探針的設(shè)計(jì)在遵循熒光PCR探針設(shè)計(jì)原則的基礎(chǔ)上，將包含更多的種特異性位點(diǎn)作為最重要的考量，同時(shí)探針引入了小溝結(jié)合物(Minor groove binder,MGB)基團(tuán)以確保其高特異性。基于TaqMan MGB探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法因?yàn)樘结樞蛄卸?，具有分辨率高、穩(wěn)定性好、背景低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR 比常規(guī)PCR(包括巢式PCR 和多重PCR)具有更高的檢測靈敏度，其他針對(duì)葡萄座腔菌屬真菌特定類群的特異性檢測研究也印證了這一點(diǎn)[25-29]。

本研究建立了蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌的TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法。該方法特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高，可以提高蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌的檢出率和檢測速度。既可用于蘋果殼色單隔孢潰瘍病菌的快速確診，也可用于進(jìn)境截獲的可疑樣品及未知蘋果病果樣品的快速篩查，在口岸植物檢疫中具有很強(qiáng)的可操作性和適用性。該檢測方法的建立可以防止蘋果檢疫性病原真菌的傳入和傳播，同時(shí)也可為進(jìn)口水果的快速通關(guān)提供有效的技術(shù)支持。