王朝歡，宋博文，余思佳，肖武名，黃 明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510642)

水稻Oryza sativaL.是世界上超過一半人口的主要糧食作物，深入挖掘重要的功能基因?qū)λ局饕r(nóng)藝性狀的遺傳改良具有重要意義。高密度遺傳圖譜的構(gòu)建為基因的精準(zhǔn)定位和克隆創(chuàng)造了必要條件。

本研究使用的重組自交系(Recombinant inbred lines，RILs)群體是由秈稻‘MDS’和秈稻‘R315’構(gòu)建的高代重組自交系，具有穩(wěn)定的表型性狀，是一個(gè)良好的永久性遺傳群體。自1988年Mc Couch 等[1]利用秈稻‘IR34583’與爪哇稻‘Bulu Dalam’衍生的F2群體構(gòu)建了第1張含135個(gè)限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)標(biāo)記的水稻分子連鎖圖譜以來，水稻的遺傳圖譜相繼誕生。傳統(tǒng)的圖譜構(gòu)建通常利用RFLP、簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplif ied polymorphic DNA，RAPD)標(biāo)記。結(jié)合多種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建可進(jìn)一步增加標(biāo)記的密度。徐建龍等[2]利用272個(gè)均勻分布的標(biāo)記(141個(gè)RFLP標(biāo)記、99個(gè)SSR 標(biāo)記、29個(gè)RAPD標(biāo)記和3個(gè)形態(tài)標(biāo)記)構(gòu)建了連鎖圖用于QTL 分析，該連鎖圖總共覆蓋基因組2 777.7 cM，相鄰標(biāo)記間平均距離為10.2 cM。早期的分子標(biāo)記，作圖距離通常較大，后期精細(xì)定位工作需要大量分離的F2代個(gè)體。隨著DNA 測序技術(shù)的快速發(fā)展，基于高通量測序的新型分子標(biāo)記越來越多地應(yīng)用于高密度遺傳圖譜的構(gòu)建[3-4]。Chen 等[5]利用148個(gè)子代組成的RIL 群體構(gòu)建了1 680.9 cM 的遺傳圖譜，平均遺傳距離為1.16 cM，共定位到23個(gè)耐鹽相關(guān)QTLs，其中，位于第1、4、12號染色體上的3個(gè)QTLs表現(xiàn)出累加效應(yīng)。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記作為第3代新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有數(shù)量多、遺傳穩(wěn)定性高以及易于自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)[6]，已成為近年來水稻高密度遺傳圖譜構(gòu)建的優(yōu)先選擇。

本研究利用全基因組測序(Whole genome sequencing，WGS)技術(shù)對秈稻‘MDS’和秈稻‘R315’構(gòu)建的1個(gè)RIL 群體進(jìn)行全基因組測序，先鑒定出兩親本間的SNP，再利用SNP構(gòu)建bin 標(biāo)記，最后構(gòu)建1張高密度遺傳圖譜，以期為進(jìn)一步深入挖掘和研究重要農(nóng)藝性狀基因奠定有利基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的材料為國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心前期收集的秈稻地方品種‘MDS’和‘R315’。父本‘MDS’是大穗、抗倒、高產(chǎn)型的地方秈稻品種，具有高光效、高養(yǎng)分利用率等特點(diǎn)。母本‘R315’是在‘象牙香占’基礎(chǔ)上改良的秈稻恢復(fù)系，具有抗病、優(yōu)質(zhì)、配合力好等特點(diǎn)，父母本雜交，F(xiàn)2代通過單粒傳法繁殖獲得高世代RILs。

1.2 CTAB 法提取植物葉片DNA

2019年晚季在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)教學(xué)科研試驗(yàn)基地的試驗(yàn)田中種植水稻親本和RILs群體(含192個(gè)株系)，每個(gè)材料按6行×6株的規(guī)模種成小區(qū)，株行距均為20 cm，單苗插植，常規(guī)栽培管理。F5代單株收種。親本及其RILs(F6代)群體取20粒飽滿種子萌發(fā)，取各個(gè)株系的幼嫩葉片(每個(gè)株系隨機(jī)取5株混樣)，按CTAB法[7]提取DNA 后送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.3 DNA 文庫構(gòu)建及測序

檢測合格的DNA 樣品通過酶切、加測序接頭、純化、PCR 擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫制備。構(gòu)建好的文庫通過Illumina(測序儀)進(jìn)行測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及分析

檢測合格的DNA 文庫進(jìn)行HiSeq 測序，產(chǎn)出Raw reads，結(jié)果以fastq 文件格式存儲。經(jīng)過過濾，得到高質(zhì)量的Clean reads。對192個(gè)子代及親本測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括測序reads數(shù)量、數(shù)據(jù)產(chǎn)量、測序錯(cuò)誤率、Q20、Q30、GC含量等。另外，將Clean data 與NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，以評估是否有其他來源的DNA 污染。將2個(gè)親本及192個(gè)子代測序數(shù)據(jù)與參考基因組(http://www.mbkbase.org/R498/)進(jìn)行比對，反映測序數(shù)據(jù)與參考基因組的相似性，覆蓋深度和覆蓋度能夠反映測序數(shù)據(jù)的均一性及與參考序列的相似性。

1.5 單核苷酸多態(tài)性檢測與標(biāo)記開發(fā)

SNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，包含單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換等?；贐urrows-Wheeler aligner(BWA)比對結(jié)果，利用群體檢測SNP的方式對親本和192個(gè)子代進(jìn)行SNP檢測。對BWA 比對結(jié)果進(jìn)行過濾：將比對到水稻參考基因組上唯一位置的reads挑選出來，采用GATK(Thegenome analysis toolkit)[8]對過濾后的bam 文件進(jìn)行群體SNP 的檢測。為減少測序錯(cuò)誤造成的假陽性SNP，要求親本SNP堿基支持?jǐn)?shù)不少于5，子代SNP堿基支持?jǐn)?shù)不少于3，統(tǒng)計(jì)雜合SNP數(shù)、純合SNP數(shù)和雜合SNP比例（雜合SNP數(shù)/總SNP數(shù)）。

基于親本基因型檢測結(jié)果，進(jìn)行親本間多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)，并選擇RIL群體的可用標(biāo)記類型(“aa×bb”型)，即2個(gè)親本的某個(gè)SNP基因型都為純合且不相同。完成標(biāo)記開發(fā)后，提取192個(gè)子代在親本多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的基因型，對分型后的標(biāo)記進(jìn)行篩選。首先進(jìn)行異常堿基檢查，子代分型結(jié)果中，可能會出現(xiàn)少數(shù)親本中沒有出現(xiàn)的堿基型，則認(rèn)為該堿基是異常堿基，堿基缺失用“—”表示；基于上述結(jié)果繼續(xù)進(jìn)行異?；蛐蜋z查，本研究群體類型為RILs，在子代分離群體中，主要以純合為主，雜合類型占比很低，雜合標(biāo)記也視為異常基因型，轉(zhuǎn)化為缺失。

1.6 高密度圖譜構(gòu)建及質(zhì)量評估

利用最終獲得的高質(zhì)量SNP標(biāo)記，對每個(gè)個(gè)體使用15個(gè)SNP滑動(dòng)窗口、步移長度為1的策略檢測RILs間的重組斷點(diǎn)，得到群體重組斷點(diǎn)分布圖。針對每個(gè)連鎖群使用JoinMap4.0對每個(gè)連鎖群的bin 標(biāo)記進(jìn)行排序(連鎖群使用回歸算法排序，采用Kosambi 函數(shù)計(jì)算遺傳距離)。根據(jù)獲得的bin 標(biāo)記的遺傳距離，使用perl SVG模塊繪制連鎖圖，并依據(jù)文獻(xiàn)[9]對標(biāo)記在基因組上的位置和遺傳圖譜進(jìn)行共線性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本性狀差異及測序數(shù)據(jù)信息分析

通過對兩親本的農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)兩親本在每穗穎花數(shù)、粒長、每穗實(shí)粒數(shù)、葉寬、株高和二級枝梗數(shù)上具有極顯著差異(P＜0.01)(圖1)，每穗穎花數(shù)、粒長、每穗實(shí)粒數(shù)、葉寬、株高、二級枝梗數(shù)是后續(xù)研究重點(diǎn)關(guān)注性狀。

圖1 親本農(nóng)藝性狀分析Fig.1 Agronomic character analysisbetween parents

通過對兩親本和RILs群體192個(gè)子代檢測合格的D N A 文庫進(jìn)行H i S e q 測序，總共獲得549 496 399 500 bp測序量。親本‘MDS’得到4 140 981 000 bp Raw reads，過濾后得到Clean reads 4 134 873 600 bp，平均測序深度為9.33×；親本‘R315’共得到4 395 794 100 bp Raw reads，過濾后得到4 390 405 500 bp Clean reads，平均測序深度9.66×。RILs群體192個(gè)子代中平均每個(gè)個(gè)體的Raw reads約2 817 557 919 bp，平均測序深度6.33×。親本總體測序質(zhì)量高，Q20≥95%，Q30≥89%，GC分布正常，‘MDS’和‘R315’中GC含量分別為43.73%和44.12%。

將2個(gè)親本及192個(gè)子代的測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對。參考基因組大小為390 983 850 bp，192個(gè)子代樣本比對率均在91%以上，1×覆蓋度(至少有1個(gè)堿基的覆蓋)平均為92.45%，對參考基因組捕獲區(qū)域的平均覆蓋深度為6.30×；比對結(jié)果可用于后續(xù)的變異檢測及相關(guān)分析。

2.2 SNP識別與基因分型

基于2個(gè)親本的基因型分析結(jié)果，開發(fā)的標(biāo)記類型及數(shù)量如圖2所示，父母親本間共鑒定出具有多態(tài)性的位點(diǎn)470 833個(gè)，可用標(biāo)記類型為“aa×bb”型，共計(jì)221 494個(gè)。

圖2 開發(fā)的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的類型及數(shù)量Fig.2 Type and quantity of developed single nucleotide polymorphism markers

對分型后的遺傳標(biāo)記進(jìn)行篩選，未發(fā)現(xiàn)異常堿基，說明基因分型準(zhǔn)確性較好。基于篩選的結(jié)果對子代分型結(jié)果進(jìn)行異?；蛐蜋z查，未發(fā)現(xiàn)雜合類型，說明RILs子代群體中，雜合類型占比較低。最終獲得221 494個(gè)有效標(biāo)記用于連鎖性分析。

2.3 高密度遺傳圖譜構(gòu)建及質(zhì)量評估

基于獲得的221 494個(gè)SNP標(biāo)記，對每個(gè)個(gè)體使用15個(gè)SNP滑動(dòng)窗口、步移長度為1的策略[9]檢測RILs間的重組斷點(diǎn)，得到群體重組斷點(diǎn)圖(圖3)。利用圖2的標(biāo)記信息，可追蹤到192個(gè)子代中每個(gè)子代的每條染色體的重組事件發(fā)生的位置。

圖3 群體重組斷點(diǎn)圖Fig.3 Group recombination breakpoint diagram

使用JoinMap4.0對每個(gè)連鎖群的bin 標(biāo)記進(jìn)行排序(連鎖群使用回歸算法排序，使用Kosambi函數(shù)計(jì)算遺傳距離)，最終獲得bin 標(biāo)記1 612 個(gè)，均勻分布在各染色體上(圖4)。用perl SVG模塊繪制連鎖圖，總圖距1 327.82 c M，覆蓋了12個(gè)連鎖群(分布在水稻的12條染色體上)，標(biāo)記間的平均圖距為0.82 cM。各個(gè)連鎖群bin 標(biāo)記數(shù)量、總圖距、平均圖距等基本信息如表1所示。其中第1號染色體(Chr 1)連鎖群圖距最長，為170.19 cM，包含bin 標(biāo)記最多，為194個(gè)，標(biāo)記間平均圖距是0.88 cM；第11號染色體(Chr 11)連鎖群圖距最短，為60.18 c M，包含bin 標(biāo)記最少，為68個(gè)，標(biāo)記間的平均圖距是0.89 cM；連鎖群中最大間隔(Maximum gap)長度小于5 cM的比例高達(dá)98.2%。

圖4 連鎖群標(biāo)記分布圖Fig.4 Distribution map of linkage group marker

表1 遺傳連鎖群信息Table 1 Characteristics of genetic linkage group

共線性分析結(jié)果(圖5)顯示，各個(gè)連鎖群上大部分標(biāo)記與在基因組上保持一致，共線性較好，圖譜質(zhì)量高。

圖5 遺傳圖譜和物理圖譜的共線性分析Fig.5 Collinearity analysis between genetic map and physical map

3 討論與結(jié)論

高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展加速了水稻重要基因的挖掘和應(yīng)用，在育種上也可以應(yīng)用相關(guān)分子標(biāo)記提高材料選育的準(zhǔn)確性，加快品種選育。運(yùn)用高通量測序獲得高質(zhì)量SNPs并構(gòu)建遺傳圖譜進(jìn)行QTL 鑒定是目前的研究熱點(diǎn)。

親本的選擇是獲得高質(zhì)量圖譜的第一步，對后續(xù)的QTL 定位也至關(guān)重要。親本間的DNA 具有多態(tài)性是選材的首要條件，在某一表型或者多個(gè)表型具有極端差異的2個(gè)材料是理想的選擇。在研究產(chǎn)量[10-12]、粒形[13-14]等性狀時(shí)，親本的目的性狀要存在極端差異。前期觀察分析發(fā)現(xiàn)秈稻‘MDS’和‘R315’在多個(gè)農(nóng)藝性狀上均存在明顯差異，包括株高、葉色、葉長、葉寬、粒形、穗粒數(shù)等。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)雙親在每穗粒數(shù)、葉寬、每穗實(shí)粒數(shù)、粒長、二次枝梗數(shù)、株高等性狀上均存在極顯著差異，預(yù)示著雙親中可能存在多個(gè)控制水稻產(chǎn)量的基因或者QTLs。接下來我們將對群體的多個(gè)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合構(gòu)建的高密度遺傳圖譜開展深入的研究。

基于重測序獲得高質(zhì)量的SNPs，再劃分bin 標(biāo)記能大幅度提高作圖的精度與效率，Huang 等[9]對150個(gè)子代的RIL群體在F8代使用287個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行基因分型，構(gòu)建的遺傳圖譜標(biāo)記間平均遺傳距離為5 cM，平均物理距離為1.4 Mb，需要3個(gè)人通過1年的工作完成；而在F11代使用重測序，每40 kb就獲得1個(gè)SNP，將重組斷點(diǎn)的分辨率提高了35倍，僅花費(fèi)2周時(shí)間，將每15個(gè)SNPs劃分為1個(gè)bin 標(biāo)記，標(biāo)記間平均遺傳距離為2.3 cM，平均物理距離為600 kb。本研究在前人基礎(chǔ)上構(gòu)建的圖譜標(biāo)記間平均遺傳距離為0.82 cM，平均物理距離為242 kb，平均每16 kb就能產(chǎn)生1個(gè)SNP，進(jìn)一步提高了重組斷點(diǎn)的分辨率。

標(biāo)記的數(shù)量也是遺傳圖譜的一個(gè)重要指標(biāo)，秈粳雜交能獲得豐富的多態(tài)性位點(diǎn)[1]，但會定位到大量的QTLs，使得后續(xù)的研究難以進(jìn)行。所以進(jìn)一步精細(xì)定位高級的作圖群體，主要指近等基因系類群體，其通過連續(xù)重復(fù)回交獲得，特征是群體中個(gè)體間遺傳背景相似，僅帶有少數(shù)供體片斷，從而消除背景的干擾和主效基因?qū)ξ⑿TLs的掩蓋作用，如導(dǎo)入系(Introgression lines，ILs)和替換系(Substitution lines，SLs)[15-16]，其目的為在保證遺傳背景更加相似的情況下得到準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究選擇了在表型上具有較大差異的2個(gè)秈稻品種作為親本，以期在去除相同的遺傳背景后得到一定的多態(tài)性遺傳標(biāo)記，準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)到差異表型的QTLs。

QTL及基因鑒定的終極目的是應(yīng)用于育種。針對水稻的重要性狀，當(dāng)前已經(jīng)定位和克隆了一些重要基因，但大部分的QTLs或基因都只停留在試驗(yàn)階段，沒能與育種實(shí)踐結(jié)合起來。其中主要的1個(gè)原因就是部分QTLs受遺傳背景影響很大，很難在不同群體中檢測到相同的QTL位點(diǎn)，這很可能是因?yàn)镼TL的上位性占據(jù)了主導(dǎo)地位[17]。主效QTL 或基因的定位，通常會選擇遺傳背景有較大差異的親本構(gòu)建群體，例如常用的秈粳雜交群體，對于群體中發(fā)現(xiàn)的有價(jià)值的QTL 想用于選育出好的品種進(jìn)行推廣，還需要進(jìn)行多次回交、自交，嚴(yán)重影響育種進(jìn)程。與此同時(shí)，得到的結(jié)果會因?yàn)椴牧匣蛘哞b定的環(huán)境改變而無法在育種中展開，最終導(dǎo)致定位到的QTL或基因與育種實(shí)踐相脫節(jié)[18-19]。本研究選擇的2個(gè)秈稻品種，在遺傳背景相對相似的情況下，獲得的QTL或基因能更加穩(wěn)定地表達(dá)，而且選擇雙親時(shí)要注重在性狀上互補(bǔ)，在高世代的RILs群體中才可以直接篩選到能穩(wěn)定遺傳的目標(biāo)株系用于水稻品種選育，從而達(dá)到使QTL鑒定與育種同步進(jìn)行、互相驗(yàn)證的目的。