朱葉，譚秋凡，鞏倩文，胡曉建，陳世豪

1.溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院 屈光手術中心，浙江 溫州 325027；2.義烏市婦幼保健院 五官科，浙江 金華 322000

圓錐角膜（keratoconus，KC）是一種多因素病因的雙側角膜變薄性疾病，以進行性角膜變薄變陡，不規(guī)則散光，視力下降，角膜前突為主要表現(xiàn)[1]。已有研究表明，遺傳因素在KC發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[2]。雖然多年來，KC的眾多候選基因已被確定，但這些孤立的基因尚不能解釋疾病的復雜機制[3]。 目前，微陣列分析作為在基因組水平上獲得基因表達數(shù)據(jù)的一種有前景的工具，已被廣泛應用于疾病的分子發(fā)生和發(fā)展研究中[4]。隨著生物信息學技術的發(fā)展，基于網(wǎng)絡的方法使疾病機制的研究更加深入。SHARIF等[5]利用蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析鑒定了EGFR、NEDD4、SNTA1、LGALS3BP、HSPB1、SDC2、Mme和HIF1a等多種網(wǎng)絡節(jié)點，這些節(jié)點被稱為關鍵（Hub）基因（蛋白質(zhì)），在維持網(wǎng)絡結構和提供生物系統(tǒng)的關鍵信息方面起著關鍵作用[6-8]。本研究在網(wǎng)絡分析的基礎上[9]，進一步使用ClueGO使基因矩陣中最重要的條目在網(wǎng)絡中可視化，為觀察他們之間的相互關系提供了更加深入的視角，同時從分子水平上進一步了解KC的發(fā)生發(fā)展，并探索了診斷、預后和藥物靶點的潛在候選的生物標志物。

1 材料和方法

1.1 微陣列分析數(shù)據(jù) 從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE77938基因表達譜。GSE77938基于Affymetrix GPL18460 平臺（Affymetrix Human，Illumina HiSeq 1500），由 KABZA等[10]提交。GSE77938數(shù)據(jù)集包含50個樣本，其中有25個KC樣本和25個正常對照樣本（下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77938）。

1.2 差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的數(shù)據(jù)預處理與鑒定 用R語言（v.3.3.2）對原始微陣列數(shù)據(jù)進行預處理?；谄脚_ 上的注釋信息，將探針I(yè)Ds轉換成相應的基因名。當 多個探針對應于同一基因時，計算平均表達值來表示基因表達水平。樣本分為KC組和對照組。然后，采用線性模型進行微陣列分析（Bioconductor的limma包）以識別DEGs。以|log2fold change（FC）| ＞0.992并且P＜0.05作為DEGs的臨界值。

1.3 DEGs的功能富集分析 基因本體論（GO，http://www.geneontology.org/）是一種常用的對基因和基因產(chǎn)物進行注釋和識別特征生物的方法。京都基因和基因組百科全書（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/Pathway.html）通路富集分析是一個包含生物化學通路的生物信息學數(shù)據(jù)庫。注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫（DAVID，http://david.abcc.Ncifcrf.gov/）在線軟件，是從大量基因中提取生物意義的分析工具。DAVID分別用于上調(diào)和下調(diào)DEGs的GO富集和KEGG通路富集分析。具有顯著差異的功能和通路的臨界值為P＜0.05，計數(shù)（在特定功能或途徑項中富集的基因數(shù)）＞2。

1.4 PPI網(wǎng)絡的構建及子網(wǎng)絡分析 檢索相互作用基因的搜索工具（STRINGv-10.0，http://stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫是用來評估PPI信息的在線工具。為了評價DEGs之間的相互作用關系，將DEGs映射到STRING上，并從蛋白質(zhì)水平篩選DEGs之間的相互作用關系。然后，在聯(lián)合評分＞0.4 的條件下，分別構建了上調(diào)和下調(diào)DEGs的PPI網(wǎng)絡。然后，利用 Cytoscape軟件構建PPI網(wǎng)絡。采用插入式分子復合物檢測技術（MCODE）對Cytoscape中PPI網(wǎng)絡的子網(wǎng)絡進行了篩選。選擇閾值節(jié)點密度截斷值為1、節(jié)點得分截斷值為0.2、k核為3、最大深度為100的聚類進行進一步分析。采用ClueGO插件對Hub基因列表進行可視化GO和KEGG分析。

2 結果

2.1 DEGs的鑒定 分析的樣本為25個KC樣本和25個正常樣本。根據(jù)篩選標準，KC患者角膜共鑒定出1 547個DEGs，其中上調(diào)基因1 103個，下調(diào)基因444個（見圖1）。

圖1 DEGs的火山圖

2.2 GO富集分析 上調(diào)和下調(diào)表達基因富集的前5個GO項見圖2。GO分析結果表明，上調(diào)的DEGs在生物過程（biological process，BP，1 220）、分子功能（molecular function，MF，102）和細胞成分 （cell composition，CC，102）中均顯著富集。在BP中，這些基因顯著參與免疫應答（P＜0.001）、免疫系統(tǒng)過程（P＜0.001）和防御應答（P＜0.001）。MF和CC的最顯著項分別是抗原結合（P＜0.001）和質(zhì)膜（P＜0.001），而下調(diào)的DEGs在BP（99）、MF（47）和CC（64）中也有富集。BP、MF和CC的最顯著富集項分別為感知覺（P＜0.001）、門控通道活性（P＜0.001）和膜內(nèi)成分（P＜0.001）。

2.3 KEGG通路分析 上調(diào)和下調(diào)基因的KEGG通路見圖3。上調(diào)的DEGs在72條通路中顯著富集，其中前5個最具有顯著差異的通路分別為細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號途徑、移植物排斥反應、類風濕關節(jié)炎和移植物抗宿主病。而下調(diào)的DEGs在8條通路中顯著富集，其中富集最顯著的前5條通路為味覺傳導、cAMP信號途徑、谷氨酸突觸、5-羥色胺能突觸和2型糖尿病。

圖2 KC相關DEGs的前5位GO功能富集分析

2.4 PPI網(wǎng)絡和子網(wǎng)絡 基于STRING數(shù)據(jù)庫的信息，分別構建了上調(diào)和下調(diào)DEGs的PPI網(wǎng)絡。在上調(diào)DEGs的PPI網(wǎng)絡中，共有602個節(jié)點和9 903個相互作用，識別出三個聚類（見圖4）。Hub基因（度＞150）為TNF（235）、JUN（231）、IFNG（216）、PTPRC （197）、ICAM1（194）、FOS（193）、IL6（192）、CXCL8 （178）、LCK（165）、CSF2（163）、MMP9（162）、ITGAX （152）、CD40LG（152）和IL10（151），對于下調(diào)的DEGs，共有143個節(jié)點和319個相互作用（見圖5）（度＞150）。

圖3 KC相關DEGs的前5位KEGG通路分析

2.5 Hub基因的ClueGO分析 通過ClueGO分析，將Hub基因和通路網(wǎng)絡進行可視化展示。結果表明，這些Hub基因顯著富集在6個GO項中（見圖6）。最顯著的是骨髓白細胞分化的陽性調(diào)節(jié)（P ＜0.01）、STAT蛋白酪氨酸磷酸化的陽性調(diào)節(jié)（P＜0.01）、平滑肌細胞增殖（P＜0.01）、平滑肌細胞增殖的調(diào)節(jié) （P＜0.01）、細胞對脂多糖的反應（P＜0.01）以及趨化因子生物合成過程的調(diào)節(jié)（P＜0.01）。而Hub基因的KEGG途徑在3個通路顯著富集（見圖7）。最顯著的是NF-κB信號通路（P＜0.01）、原發(fā)性免疫 缺陷（P＜0.01）和T細胞受體信號通路（P＜0.01）。

圖5 PPI網(wǎng)絡用于表示下調(diào)表達的DEGs

3 討論

KC是一種異質(zhì)性退行性疾病。其病因和潛在的病理機制尚不清楚，但環(huán)境和遺傳因素都被認為是導致該疾病發(fā)展的相關因素[11-12]。最近，12項不同的KC研究已經(jīng)確定了至少17個基因座，表明KC可能是由不同家族的許多不同基因突變引起的[13]，因此了解KC的分子機制和關鍵基因對于診斷和治療具有重要意義。本研究從GSE77938中提取數(shù)據(jù)，利用生物信息學分析鑒定KC和正常對照之間1 103個上調(diào)和444個下調(diào)的DEGs。為了更好地理解DEGs的相互作用進一步進行了GO功能富集分析、KEGG通路分析和PPI網(wǎng)絡分析。通過構建PPI并應用MCODE和ClueGO插件發(fā)現(xiàn)了一些Hub基因和關鍵通路，為KC的治療研究提供了新的思路。

構建了上調(diào)和下調(diào)DEGs的PPI網(wǎng)絡后，發(fā)現(xiàn)最高度的基因（度＞20）均處于上調(diào)DEGs中，充分提示上調(diào)的DEGs具有KC的生物活性。GO分析表明，上調(diào)的DEGs在BP方面主要參與免疫應答、免疫系統(tǒng)過程和防御應答的調(diào)控等過程。MF和CC主要表現(xiàn)在抗原結合、受體結合、細胞因子活性和質(zhì)膜、細胞外周，這些結果表明，該病的病因與免疫反應可能存在根本的聯(lián)系或相關性。而過去研究發(fā)現(xiàn)KC患者血清免疫球蛋白E水平較高，免疫穩(wěn)態(tài)受到損害等表現(xiàn)也從側面確認了變態(tài)反應和KC之間的聯(lián)系 性[14-16]。此外，上調(diào)DEGs富集的KEGG通路主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用和趨化因子信號途徑，這與角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞能夠合成趨化因子、細胞因子及其受體，以及這些分子在角膜傷口愈合和炎癥反應中能夠發(fā)揮作用的認識是一致的[17]。WHEATER等[18]報道在其他類型的角膜疾病中，如大皰性角膜病變，這些通路也發(fā)生了變化。

通過用上調(diào)的DEGs構建PPI網(wǎng)絡，并應用MCODE和ClueGO，發(fā)現(xiàn)了幾個重要的通路（骨髓白細胞分化的陽性調(diào)節(jié)，STAT蛋白酪氨酸磷酸化的陽性調(diào)節(jié)，平滑肌細胞增殖，平滑肌細胞增殖的調(diào)節(jié)，細胞對脂多糖的反應、趨化因子生物合成過程的調(diào)控、NF-κB 信號通路、原發(fā)性免疫缺陷和T細胞受體信號通路）和14個Hub基因，這些通路和基因可能是診斷KC的有效途徑。

本研究相比KABZA等[10]的研究最大的不同也是本研究的主要創(chuàng)新點在于，本研究不僅僅分析了基因的表達差異，同時結合了GO進行數(shù)據(jù)分析（KABZA等[10]的研究并未使用GO分析方法），且發(fā)現(xiàn)了關聯(lián)基因TNF、JUN、IFNG、PTPRC、ICAM1、FOS、IL6、CXCL8、LCK、CSF2、MMP9、ITGAX、CD40LG和IL10。在這些發(fā)現(xiàn)的與KC相關聯(lián)的基因中，TNF、IFNG、PTPRC、ICAM1、FOS、CXCL8、LCK、CSF2，ITGAX基因之前未見報道。

本研究中，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）基因在網(wǎng)絡中顯示出最高的度（232）。TNF作為一種主調(diào)節(jié)因子在平衡細胞存活、凋亡和壞死中的作用已經(jīng)在各種細胞類型和組織中被廣泛研究[19]。有研究發(fā)現(xiàn)單側KC患者和對側有亞臨床疾病的患者，雙眼IL-6和TNF-α水平均升高，但TNF-α只在KC眼中顯著升高[20]。CHEUNG等[21]發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠觸發(fā)角膜細胞凋亡，以及增加膠原蛋白的更新率。此外，POULIQUEN等[22]認為TNF-α可能調(diào)節(jié)一個涉及纖溶酶系統(tǒng)的蛋白酶級聯(lián)反應，最終導致KC細胞外基質(zhì)的變化。

據(jù)報道，PPI網(wǎng)絡中的IL6、MMP9、IL10等基因在KC患者以及角膜下壁變薄病例（類似KC）的淚液中也有明顯升高。這是一個非常有力的證據(jù)，同樣支持角膜變薄和擴張與涉及炎癥事件的細胞外基質(zhì)降解有關（主要是MMP-9、IL-6和TNF-α水平升 高）[23-24]。

本研究在KC中獲得了一些重要的基因和通路，但還存在一些局限性：基于生物信息學方法進行探究，結論尚未得到生物學實驗的證實；研究樣本量有限。進一步探討KC的分子機制，并將分子遺傳學診斷應用于臨床，有待進一步地探索[25]。

綜上所述，本研究提出了幾個與KC相關的Hub基因，系統(tǒng)地介紹了與之相關的生物過程和信號傳導通路，這些基因很少有被證實，但其中有許多被報道與KC有關。這些基因可作為KC治療的分子靶點和診斷性生物標志物，應引起更多的研究關注。通過生物信息學分析揭示這些基因有可能與KC的病理機制相關，后續(xù)的研究需要利用細胞實驗和動物實驗進行深入的驗證，為尋找新的靶點藥物奠定關鍵的科學基礎。

圖7 上調(diào)DEGs中Hub基因的ClueGO分析