朱融和，孫媛媛，王凱，王楸

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，浙江 溫州 325015

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是由于各種圍生期因素引起的腦缺氧或缺血而形成的常見腦損傷，是兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的新生兒期的重要疾病之一，探索HIE的發(fā)病機(jī)制是尋求該病有效治療方案的根本途徑[1]。炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在HIE發(fā)病過程中起重要的作用，細(xì)胞死亡可釋放出細(xì)胞外組蛋白[2]。在體外研究中，細(xì)胞外組蛋白可損傷內(nèi)皮細(xì)胞[3]、刺激細(xì)胞因子的釋放[4]，并能誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的形成和髓過氧化物酶的釋放。因此，若能將細(xì)胞外組蛋白阻斷，中和或降解其細(xì)胞毒性作用，對減少HIE的發(fā)生具有重要的臨床意義。本研究通過建立7日齡新生SD大鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型，外源性給予抗組蛋白中和抗體，觀察其對HIBD是否有保護(hù)作用，并且研究細(xì)胞外組蛋白是否通過凋亡途徑參與HIBD的發(fā)生與進(jìn)展。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：7日齡新生SD大鼠54只，體質(zhì)量12～15 g，雌雄不限，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。利用隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法將其分成3組，分別 為：假手術(shù)組、HIBD組和治療組，每組18只。造模后各組又隨機(jī)分為3個(gè)亞組：6 h組、24 h組和72 h組。每個(gè)亞組6只。

1.1.2 主要試劑：8%氧氮混合氣體購自廣州氣體廠；檢測細(xì)胞外組蛋白ELISA試劑盒（Cell Death Detection Kit）購自德國Roche公司；特異性組蛋白H4中和抗體購自南京金斯瑞生物科技有限公司；兔抗鼠anti-cleaved casepase-3 抗體，antiβ-actin抗體及山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司，TUNEL染色試劑盒、尼氏（Nissl）染色液及Western blot相關(guān)試劑均購自南通碧云天生物技術(shù)研究所，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：缺氧缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛥⒖嘉?獻(xiàn)[5]。7日齡新生SD大鼠游離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，術(shù)后2 h后置于37 ℃恒溫水浴的缺氧艙，以2 L/min 的速度輸入8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，2 h后 取出并返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不做結(jié)扎和缺氧處理。治療組在造模前5 min尾靜脈注射特異性組蛋白H4中和抗體 20 mg/kg，假手術(shù)組和HIBD組尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 ELISA法檢測血漿細(xì)胞外組蛋白水平：各組動(dòng)物在造模后6 h、24 h和72 h，采取心臟采血法。收集血液標(biāo)本，3 000 r/min離心10 min分離血清，ELISA法檢測血清中組蛋白水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 HE染色：取各組造模后24 h及72 h亞組的左側(cè)腦組織標(biāo)本（n=3/亞組）以4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.2.4 腦含水量檢測：取各組造模后24 h亞組的完整腦組織（n=3/亞組），沿大腦中線將左右側(cè)大腦分開并稱量濕重。然后，在105 ℃恒溫箱中干燥48 h 并稱量干重。根據(jù)公式計(jì)算腦含水量：腦含水量= （濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.5 尼氏染色：腦組織石蠟切片脫蠟、水化、 0.5%甲基紫避光染色20 min，PBS漂洗后分化6 s、無水乙醇脫水，二甲苯透明、封片觀察，利用Imagepro plus6.0 圖像分析軟件分析結(jié)果，計(jì)算公式：腦組織損失率=（右側(cè)正常腦組織面積-左側(cè)剩余正常腦組織面積）/右側(cè)正常組織面積×100%。

1.2.6 組織蛋白提取及Western blot分析：分離造模72 h后的左側(cè)大腦皮層（n=3/組），加入組織裂解液，組織勻漿機(jī)勻漿后低溫下12 000 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白濃度并稀釋到相同濃度，按比例加入5×上樣緩沖液，100 ℃金屬浴5 min。取30 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉30 min，抗cleaved casepase-3、β-actin抗體4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光暗室顯影后對膠片進(jìn)行拍攝，利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.7 TUNEL染色：石蠟切片脫蠟至水，用蛋白酶K工作液處理15 min，PBS漂洗3次，滴加TUNEL反應(yīng)液避光孵育60 min，PBS漂洗3次后加DAPI染色 5 min，再用PBS漂洗3次，顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織肉眼大體觀察及腦含水量測定 造模后24 h的大體觀察，與假手術(shù)組相比，HIBD組左側(cè)腦組織有明顯水腫；治療組與HIBD組相比，左側(cè)腦組織水腫程度明顯輕（見圖1A）。HIBD組腦含水量比假手術(shù)組高（P＜0.05），治療組較HIBD組含水量低 （P＜0.05），見圖1B。

2.2 腦組織HE染色觀察 假手術(shù)組在6 h、24 h和72 h腦組織結(jié)構(gòu)層次均清晰，細(xì)胞輪廓正常，細(xì)胞核界限清晰，核仁明顯，尼氏體均勻分布在核周圍。HIBD組造模24 h后左側(cè)腦細(xì)胞大片壞死，神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞可見核固縮、核碎裂；72 h后左側(cè)腦組織在大片壞死的背景下，神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象明顯（黑色箭頭），可見大量的核固縮、核碎片。治療組造模24 h后可見左側(cè)腦細(xì)胞輕度水腫，較HIBD組明顯好轉(zhuǎn)；72 h后可見少數(shù)嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象（黑色箭頭）。見圖2。

圖1 腦組織大體形態(tài)學(xué)觀察及腦含水量測定

圖2 新生大鼠左側(cè)大腦組織HE染色結(jié)果（×400）

2.3 腦組織尼氏染色觀察 假手術(shù)組大腦皮層、海馬區(qū)和紋狀體細(xì)胞排列有序，結(jié)構(gòu)分明（見圖3A）。HIBD組出現(xiàn)明顯的損傷，結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞大量丟失（見圖3B）。與HIBD組相比，治療組細(xì)胞變性和壞死情況減輕（見圖3C），腦組織損失率測定HIBD組較假手術(shù)組增加，而治療組較HIBD組減少（P ＜0.01），見圖3D。

2.4 各組血漿細(xì)胞外組蛋白水平變化 假手術(shù)組在造模后6 h、24 h和72 h時(shí)血漿細(xì)胞外組蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HIBD組在造模后6 h、24 h和72 h時(shí)血漿細(xì)胞外組蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），并且分別明顯高于假手術(shù)組相同3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組蛋白水平（均P＜0.05）；治療組在造模后6 h、24 h和72 h時(shí)血漿細(xì)胞外組蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），并且分別低于HIBD組相同3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組蛋白水平（均P ＜0.01）。見圖4。

圖3 造模72 h后的腦組織尼氏染色

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)血漿細(xì)胞外組蛋白水平

2.5 各組細(xì)胞凋亡情況 造模72 h后TUNEL染色檢測腦組織細(xì)胞凋亡情況，假手術(shù)組基本沒有細(xì)胞凋亡，HIBD組較假手術(shù)組細(xì)胞凋亡量高（P＜0.01）；而治療組較HIBD組細(xì)胞凋亡的數(shù)量低（P＜0.01）。見圖5。

2.6 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 檢測造模72 h后組織凋亡蛋白的表達(dá)情況，HIBD組凋亡蛋白cleaved caspase-3較假手術(shù)組表達(dá)高（P＜0.05），而治療組較HIBD組cleaved caspase-3表達(dá)低（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

組蛋白是染色質(zhì)的主要成分之一，在細(xì)胞核內(nèi)含量豐富且非常恒定，主要包括5種類型：H1、H2A、H2B、H3和H4[6]。細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)染色質(zhì)降解，核內(nèi)組蛋白被釋放至細(xì)胞外成為細(xì)胞外組蛋白[7]。細(xì)胞外組蛋白具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，不僅能殺傷入侵的微生物病原體，同時(shí)其自身毒性與敗血癥[8]、血栓[9]、自身免疫性疾病[10-11]及腫瘤[12]等相關(guān)，還 會(huì)對肺[13]、肝[14]、腎[15]等臟器造成損傷，表明細(xì)胞外組蛋白可能是一種參與各種炎癥損傷過程的致病 因子[16]。但是，目前關(guān)于細(xì)胞外組蛋白對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是HIBD中的作用效應(yīng)仍不清楚。

國內(nèi)學(xué)者通過建立大鼠腦缺血再灌注（I/R）損傷模型，發(fā)現(xiàn)I/R損傷后腦內(nèi)局部的組蛋白濃度和細(xì)胞外組蛋白水平均升高，而細(xì)胞外組蛋白可直接導(dǎo)致培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞死亡，提示細(xì)胞外組蛋白在腦I/R損傷中發(fā)揮重要作用[17]。DE MEYER等[18]研究發(fā)現(xiàn)，腦組織在I/R損傷后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞外染色質(zhì)水平升高，而用抗組蛋白抗體中和細(xì)胞外組蛋白可以明顯改善小鼠的神經(jīng)功能及運(yùn)動(dòng)功能，保護(hù)腦組織并減少梗死灶體積。相關(guān)的臨床研究[19-20]也證實(shí)了上述的觀點(diǎn)，腦卒中患者外周血核小體水平顯著增加，且與嚴(yán)重程度正相關(guān)。然而在HIE患兒中，外周血中細(xì)胞外組蛋白水平變化規(guī)律及其是否存在加重腦損傷的直接效應(yīng)，阻斷其表達(dá)是否對HIE有一定的保護(hù)作用，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究在發(fā)現(xiàn)HIBD模型中細(xì)胞外組蛋白含量明顯上升的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過在缺氧缺血前尾靜脈注射特異性組蛋白H4中和抗體，結(jié)果顯示在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)治療組血漿中細(xì)胞外組蛋白含量較HIBD組明顯下降，并且腦組織水腫壞死減少，提示細(xì)胞外組蛋白參與HIBD的過程。

LEE等[21]的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡參與了HIBD的損傷過程。FANG等[22]的研究發(fā)現(xiàn)可以通過抑制凋亡減輕HIBD。為了進(jìn)一步探索細(xì)胞外組蛋白是否參與HIBD的損傷及其可能的機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測了各組腦組織中凋亡相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)HIBD組的腦組織凋亡程度增加，而注射抗組蛋白中和抗體的治療組腦組織凋亡程度較HIBD組減輕，提示細(xì)胞外組蛋白可以促進(jìn)凋亡引起腦損傷，這可能是其參與HIBD過程的機(jī)制。

圖5 TUNEL染色檢測凋亡情況（×100）

本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞外組蛋白可能是通過凋亡途徑參與缺氧缺血后腦損傷的進(jìn)程，抗組蛋白中和抗體對新生大鼠缺氧缺血后引起的腦損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖6 Western blot檢測cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況