劉 芳，袁宗勝，嚴(yán)俊杰，黃珊珊，謝寶貴*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 菌物研究中心,福建 福州 350002;2.閩江學(xué)院 海洋研究院,福建 福州 350108)

銀耳(TremellafuciformisBerk),又稱白木耳、雪耳,其在真菌的分類學(xué)地位中歸屬于擔(dān)子菌門、傘形亞門、銀耳綱、銀耳目、銀耳科、銀耳屬[1,2]。銀耳富含膠質(zhì)、膳食纖維和鈣,可降低血液和肝臟中的膽固醇,有助于體內(nèi)廢物排除、肝臟解毒[3,4]。在銀耳蛋白質(zhì)中富含17種氨基酸,這些氨基酸和酸性異多糖、有機(jī)磷、有機(jī)鐵等化合物能增強(qiáng)人體的免疫能力[5-8]。

新鮮的銀耳子實(shí)體顏色是潔白色或乳白色的,有許多薄而波卷狀褶的瓣片,叢集成牡丹花狀,瓣片不分叉或在頂部分叉,表面光滑,富有彈性,直徑8～16 cm[9]。從廣義上來(lái)說(shuō),銀耳菌絲包括銀耳純菌絲(純白菌絲,俗稱白毛團(tuán),屬擔(dān)子菌)和香灰菌絲(羽毛狀菌絲,屬子囊菌)[10]。由于銀耳純菌絲和香灰菌絲在生態(tài)條件上存在差異性,再加上銀耳菌絲體本身具有生理特殊性[11],所以在銀耳制種上以及在銀耳生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中很容易發(fā)生病害。

2017年我們?cè)诟＝ㄊ∪魇杏认h銀耳生產(chǎn)菇房?jī)?nèi)發(fā)現(xiàn)了白霉菌感染的病害,該病害發(fā)展迅速,在發(fā)現(xiàn)該病害的菇房?jī)?nèi)約有10%的銀耳受到了白霉菌的影響,并且發(fā)病后的銀耳已不適合食用,該病害的發(fā)生對(duì)銀耳生產(chǎn)造成了極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(此前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道),為此本文對(duì)其病原菌進(jìn)行了分離鑒定,并分析了其生物學(xué)特性,旨在為后續(xù)病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與主要試劑

病原真菌的分離培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，其配方為:新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL。PDB培養(yǎng)基配方:新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL。

病原真菌DNA提取和ITS片段擴(kuò)增所用的引物、Marker、dNTPs、Buffer、溶菌酶等試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品, 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 病原菌的分離純化

在無(wú)菌條件下,將受感染的銀耳子實(shí)體發(fā)病部位切下一個(gè)小組織塊,接種于添加1倍氨芐的PDA抗性平板上,用封口膜封口后正置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)5～6 d后,在PDA抗性平板上觀察到生長(zhǎng)受限和不規(guī)則邊緣的小型乳白色真菌菌落,在長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行單孢分離純化,直到分離出純培養(yǎng)物。

1.3 病原菌的致病性測(cè)定

從純化的平板上挑取一小塊菌絲，將其轉(zhuǎn)移到PDB培養(yǎng)基中,置于150 r/min的搖床上30 ℃恒溫培養(yǎng)10 d。然后用過(guò)濾法將菌絲體與PDB分離,用濾液制成孢子懸浮液(1×107conidia/mL)。用濃度為1×107conidia/mL的孢子懸浮液噴灑于正常生長(zhǎng)的銀耳子實(shí)體上,以噴灑無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照,確保供試的銀耳菌體的每一個(gè)子實(shí)體都被噴上孢子懸浮液。銀耳子實(shí)體培養(yǎng)室的溫度控制在23 ℃,相對(duì)濕度控制在95%。

在參加病原物致病性實(shí)驗(yàn)的銀耳子實(shí)體產(chǎn)生病害現(xiàn)象后，按照1.2中的方法重新分離病原菌,同樣以無(wú)菌水噴灑健康銀耳子實(shí)體為對(duì)照。觀察所產(chǎn)生的癥狀，以確定是否為同一病原菌。

1.4 病原菌形態(tài)觀察與ITS序列鑒定

1.4.1 病原菌形態(tài)觀察 平板觀察:將得到的純化培養(yǎng)物在PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d左右,觀察PDA平板上病原菌菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育情況。

顯微鏡觀察:在潔凈的載玻片上滴加10 μL的蒸餾水,用解剖針挑取在PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d左右的病原菌單個(gè)菌落到載玻片上,蓋上蓋玻片并滴加棉蘭染色液,吸去多余的染色液；在靜置染色1 min后用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。另外還通過(guò)掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4.2 病原菌rDNA ITS序列的測(cè)定與分析 采用CTAB法提取病原菌的DNA,并對(duì)提取的DNA進(jìn)行下一步的PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增選用的引物是真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行專業(yè)測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank(NCBI, http://www.ncbi.nlm.gov)中進(jìn)行BLAST同源性分析。用MEGA 5.0軟件采用最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1000次。

1.5 病原菌生物學(xué)特性的測(cè)定

1.5.1 溫度對(duì)病原菌菌絲體生長(zhǎng)的影響 將病原菌在PDA平板上培養(yǎng)12 d,然后用直徑為6 mm的打孔器打取菌落圓片,用接種針將菌落圓片接種至PDA平板中心,置于不同溫度下恒溫培養(yǎng),溫度設(shè)置35、30、25、20、15、10、5 ℃共7個(gè)處理,每個(gè)處理3次重復(fù),定期觀察菌落的生長(zhǎng)情況,測(cè)量菌落直徑,計(jì)算菌絲體的生長(zhǎng)速度。

1.5.2 pH值對(duì)病原菌菌絲體生長(zhǎng)的影響 在無(wú)菌條件下,將融化好的PDA培養(yǎng)基用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值,pH值設(shè)置10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5共12個(gè)處理。用接種針將病原菌菌落圓片接種到不同pH值的PDA平板中心,置于25 ℃下恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù)。定期觀察平板上的菌落生長(zhǎng)情況,測(cè)量菌落直徑,計(jì)算菌絲體的生長(zhǎng)速度。

1.5.3 碳源對(duì)病原菌菌絲體生長(zhǎng)的影響 以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照組,采用蔗糖、麥芽糖、淀粉作為碳源來(lái)替代葡萄糖作為處理組。用接種針將病原菌菌落圓片接種到以上不同碳源的PDA平板中心,置于25 ℃下恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù)。定期觀察平板上的菌落生長(zhǎng)情況,測(cè)量菌落直徑,計(jì)算菌絲體的生長(zhǎng)速度。

1.5.4 氮源對(duì)病原菌菌絲體生長(zhǎng)的影響 以蛋白胨為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照組,分別用酵母粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉來(lái)代替蛋白胨作為處理組。用接種針將病原菌菌落圓片接種到以上不同氮源的PDA平板中心,置于25 ℃下恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù)。定期觀察平板上的菌落生長(zhǎng)情況,測(cè)量菌落直徑,計(jì)算菌絲體的生長(zhǎng)速度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化與致病性

銀耳白霉病在發(fā)病初期出現(xiàn)針狀小白點(diǎn),與銀耳耳片顏色相近,不易被肉眼察覺(jué)。隨著菇房?jī)?nèi)溫度和濕度的逐漸升高,這些白色的針狀小點(diǎn)迅速生長(zhǎng)成為肉眼可見(jiàn)的白色真菌物質(zhì),擴(kuò)散成一層白色絨毛狀的真菌物質(zhì)，覆蓋在銀耳耳片的表面(圖1B)。隨著病害的進(jìn)一步發(fā)展,整個(gè)銀耳子實(shí)體腐爛,耳片膠化,整朵銀耳腐壞變成淺黃色的膠狀物質(zhì)。病原菌在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d后,在PDA抗性平板上生長(zhǎng)至一定程度后不再擴(kuò)散,并形成不規(guī)則邊緣的小型乳白色真菌菌落；在長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行單孢分離純化,直到分離出純培養(yǎng)物。

在供試銀耳子實(shí)體上噴灑孢子懸浮液1 d后,在每個(gè)子實(shí)體的表面觀察到白色真菌菌落(圖1C、圖1D)；在繼續(xù)培養(yǎng)后會(huì)產(chǎn)生淺黃色膠狀物質(zhì)(圖1E)；所產(chǎn)生的癥狀與原始樣本中發(fā)現(xiàn)的癥狀完全一樣,而對(duì)照組則無(wú)癥狀。從接種發(fā)病病斑上再次分離的病原菌與接種病原菌相同,證明所接病原菌為銀耳白霉病的致病菌。

A:正常銀耳子實(shí)體。B:發(fā)病銀耳子實(shí)體。C:回接1 d后的銀耳耳片。D:回接后的整個(gè)銀耳子實(shí)體。E:回接發(fā)病最后的銀耳子實(shí)體。

2.2 病原菌的形態(tài)觀察與鑒定

2.2.1 病原菌平板觀察 病原菌在PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d左右,觀察發(fā)現(xiàn)菌絲為純白色,菌絲之間通過(guò)相互交叉分支進(jìn)行生長(zhǎng),逐漸生長(zhǎng)成為肉眼可見(jiàn)的菌落并產(chǎn)生分生孢子。該病原菌是通過(guò)擲孢子進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的(圖2A)。

2.2.2 顯微鏡觀察 普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明,病原菌菌絲細(xì),有分支,無(wú)隔膜的菌絲寬度約為2.5 μm;在菌絲尖端或周圍有許多分生孢子,分生孢子的長(zhǎng)度約為10 μm,寬度約為5 μm,呈現(xiàn)一個(gè)彎彎月亮的形態(tài)。該病原菌的分生孢子著生方式為頂端著生,在孢子成熟后直接掉落在菌絲周圍或者以擲孢子進(jìn)行擴(kuò)散生長(zhǎng)(圖2B)。

掃描電鏡顯微觀察結(jié)果(圖2C)顯示：孢子的著生方式為頂端著生；未成熟將要掉落的孢子沒(méi)有明顯的彎月亮形狀；成熟的孢子與菌絲之間的連接梗越來(lái)越細(xì),直到孢子成熟后擲出去。

A:在PDA培養(yǎng)基表面的擲孢子菌落。B:普通光學(xué)顯微鏡400倍下頂端著生的分生孢子。C:掃描電子顯微鏡7000倍下的分生孢子。

2.3 病原菌rDNA ITS序列的分析

對(duì)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的ITS片段的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,顯示該病原菌的rDNA ITS片段長(zhǎng)度為1184 bp。將該序列提交給NCBI基因庫(kù),所得到的登錄號(hào)為MG806985。在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性分析，結(jié)果表明,該病原菌與Melanotaeniumendogenum和Melanotaeniumcingens的序列重復(fù)性為49%,最為接近。通過(guò)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3),發(fā)現(xiàn)該病原菌與Melanotaeniumendogenum在同一個(gè)分支上,確定該病原菌屬于黑粉菌屬(Melanotaenium)。

括號(hào)中的序號(hào)表示菌株的GenBank登錄號(hào);各分支點(diǎn)顯示的數(shù)字代表通過(guò)1000次重復(fù)運(yùn)算得到的置信值。

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 病原菌菌絲平均生長(zhǎng)速度計(jì)算結(jié)果(圖4)表明,該病原菌在不同的溫度條件下菌絲生長(zhǎng)速度存在很明顯的差異。該病原菌在15～30 ℃的PDA平板上均可以生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快,達(dá)3.18 mm/d,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其它溫度下的生長(zhǎng)速度；當(dāng)溫度低于15 ℃或者超過(guò)35 ℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)。因此，確定該病原物菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃。

圖4 溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.4.2 pH值對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 病原菌菌絲平均生長(zhǎng)速度計(jì)算結(jié)果(圖5)表明,該病原菌在所設(shè)定的12個(gè)pH值下均可以生長(zhǎng),其中生長(zhǎng)速度最快即最適的pH值為4.5。另外，病菌菌絲體在偏酸性和偏堿性的條件下均生長(zhǎng)良好,并且酸性越大和堿性越大菌絲生長(zhǎng)越好,說(shuō)明該病原菌的菌絲生長(zhǎng)對(duì)pH的要求呈現(xiàn)兩極化。

圖5 pH值對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.4.3 碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 圖6的結(jié)果表明,該病原菌對(duì)葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉4種碳源均能加以利用,其中對(duì)淀粉的利用率最高,其次是葡萄糖,而對(duì)麥芽糖和蔗糖的利用率較低。

圖6 碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.4.4 氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 病原菌菌絲平均生長(zhǎng)速度計(jì)算結(jié)果表明,該病原菌對(duì)蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉5種氮源均可加以利用,其中對(duì)硝酸鈉的利用率最高,其次是蛋白胨和尿素,而對(duì)酵母粉和硫酸鈉的利用率較低(圖7)。

圖7 氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：銀耳白霉病的病原菌屬于黑粉菌屬(Melanotaenium),該病原菌與Melanotaeniumendogenum和Melanotaeniumcingens的序列重復(fù)性僅為49%,說(shuō)明該病原菌極有可能為一個(gè)新的物種；該病原物菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃,這與寄主銀耳菌絲的最適生長(zhǎng)溫度(22～25 ℃)及子實(shí)體的最適生長(zhǎng)溫度(20～25 ℃)吻合,故不能通過(guò)溫度控制來(lái)抑制該病害的發(fā)生；該病原菌對(duì)酸堿度的適應(yīng)能力很強(qiáng),在pH 4.5～10.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)良好，但菌絲生長(zhǎng)的最適pH值為4.5;該病原菌對(duì)多種氮源、碳源均可吸收利用,是一種生長(zhǎng)能力很強(qiáng)的真菌。

銀耳病害的發(fā)生是由多種因素決定的,除病原菌外,環(huán)境條件和寄主也極為重要[12]。每種病原菌均有一定的寄主范圍,只能侵染某種或幾種食用菌；即使對(duì)于同一種食用菌，不同品種、品系或個(gè)體在發(fā)病程度上也有一定的差距。該病原菌對(duì)其它的食用菌會(huì)不會(huì)造成同樣的危害,以及該病害的致病機(jī)制等還有待進(jìn)一步研究。