汪 虎，劉慶國，陳 勇*，李 義

(1.安徽省宿州中糧生物化學(xué)有限公司，安徽 宿州234000；2.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京210032；3.吉林中糧生化有限公司，吉林 長春 130033)

乙醇作為一種特殊的化學(xué)品被廣泛應(yīng)用于化工、食品及醫(yī)療行業(yè)，也被用作于燃料添加劑和汽油增強(qiáng)劑[1]，甚至被視為未來的能源替代品。目前燃料乙醇主要依賴于生物發(fā)酵法生產(chǎn)，然而傳統(tǒng)生物發(fā)酵法存在天然缺陷，如機(jī)械性損傷及不適的液體環(huán)境導(dǎo)致的酵母細(xì)胞生長穩(wěn)定性和耐受性較差、易發(fā)生顯著的細(xì)胞衰亡和自溶現(xiàn)象以及時(shí)空效率低等[2,3]。另外，大接種量發(fā)酵導(dǎo)致碳源流向菌體生長代謝，降低了淀粉糖利用效果，從而表現(xiàn)為較低的糖醇轉(zhuǎn)化率。生物發(fā)酵的低時(shí)空效率和低產(chǎn)物得率使得燃料乙醇發(fā)酵技術(shù)的成熟度偏低，生產(chǎn)成本偏高[4]。

與傳統(tǒng)游離細(xì)胞發(fā)酵相比，固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵具有許多優(yōu)勢，如細(xì)胞濃度高、對產(chǎn)物抗性強(qiáng)、催化劑重復(fù)使用等[5-6]。酵母細(xì)胞固定化主要有兩種方法：吸附法和包埋法。包埋載體一般會(huì)存在載體降解和傳質(zhì)受限的問題，如瓊脂、凝膠、卡拉膠和海藻酸鈣等。吸收材料是一種簡單廉價(jià)的固定化細(xì)胞的載體，傳質(zhì)效果明顯優(yōu)于包埋材料[7]，如高粱甘蔗渣[8]、硅藻土[9]、玉米秸稈[10]、多孔陶瓷[11]、海綿[12]和蠶繭[7]等。然而這些載體多存在發(fā)酵空間利用率低、生物抗降解性能差以及對原料來源要求高等缺陷。

本研究首次以改良纖維為吸附載體，進(jìn)行高濃度產(chǎn)物耐受性試驗(yàn)，并以陳化糧(水稻)為原料，進(jìn)行高濃度燃料乙醇發(fā)酵研究，為乙醇高濃度工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料及方法

1.1 菌種

安琪耐高溫釀酒酵母。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基：麥芽汁固體培養(yǎng)基(麥芽250 g/L磨碎過濾，加瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min，備用)。

種子培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸銨4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L；115 ℃滅菌15 min，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏3 g/L、蛋白胨4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀 3 g/L、硫酸銨 4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、7水合硫酸亞鐵0.05 g/L、7水合硫酸鋅0.05 g/L；115 ℃滅菌15 min，備用。

1.2.2 培養(yǎng)條件 (1)種子培養(yǎng)：挑取一環(huán)經(jīng)麥芽汁活化的斜面種子于200 mL的種子液中，并置于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床培養(yǎng)18 h。

(2)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)及固定：將裝有6 g毛巾的500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮種子培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分?jǐn)?shù))的種子液加到錐形瓶中。再置于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的搖床上固定36 h。

(3)固定化細(xì)胞發(fā)酵：將固定結(jié)束后的廢液倒出，加入含有不同葡萄糖濃度和乙醇濃度的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的搖床上培養(yǎng)若干時(shí)間。該實(shí)驗(yàn)為破壞性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行搖瓶，每隔3 h取一次樣，共取9次。

(4)游離細(xì)胞發(fā)酵：向500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮種子培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分?jǐn)?shù))的種子液加到錐形瓶中。再置于溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間與固定化細(xì)胞擴(kuò)大及固定階段的時(shí)間相同；再以4000 r/min，離心5 min。離心后的酵母重新溶在200 mL的含有不同乙醇濃度的新鮮培養(yǎng)基中。每個(gè)乙醇濃度做3個(gè)平行搖瓶，每隔3 h取一次樣，共取9次。

(5)水稻發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：固定化過程同耐受性試驗(yàn)過程。在正式發(fā)酵前，將種子培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度替換成240 g/L(避免載體吸水稀釋發(fā)酵過程中的乙醇濃度，對后面正式發(fā)酵產(chǎn)生影響)，培養(yǎng)24 h。結(jié)束后進(jìn)行正式發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基用水稻水解液替代。在單批發(fā)酵(游離和固定化)中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣，總共6個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，發(fā)酵時(shí)間48 h。在間歇式發(fā)酵過程中，發(fā)酵時(shí)間48 h下瓶取樣分析，同時(shí)換液進(jìn)行下一批發(fā)酵。以上發(fā)酵條件均為：轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度34 ℃。

1.3 分析方法

OD測定：將游離酵母稀釋一定倍數(shù)，通過可見分光光度計(jì)，在波長為660 nm的條件下檢測；固定化酵母通過震蕩從纖維床上解離下來，然后用上述方法測得OD值。細(xì)胞濃度與OD的標(biāo)曲：1 OD=0.81 g DCW/L=1×107個(gè)/mL。

糖測定：葡萄糖測定用生物傳感分析儀SBA。還原糖：采用DNS法[4]。總糖含量的測定：取適量的樣品加入50 mL離心管中，然后加入5 mL濃硫酸和5 mL純水，沸水浴10 min，使總糖完全水解。置于冰水中冷卻后，加一滴酚酞指示劑，用6 mol/L的NaOH中和至微紅色，最后定容至50 mL。之后按照上述DNS的測定方法測定水解后的還原糖的含量，即總糖含量。

酒度測定：取100 mL發(fā)酵液，加熱蒸餾，定量到100 mL，用酒度計(jì)進(jìn)行測量。

乙醇測定：采用氣相色譜法，初始柱溫70 ℃，升溫速率20 ℃/min，終止溫度為190 ℃；前進(jìn)樣口溫度180 ℃，前檢測器溫度220 ℃；氫氣流速30 mL/L，空氣流速200 mL/L，氮?dú)饬魉?0 ml/L。

細(xì)胞數(shù)測定：采用血球計(jì)數(shù)法，取2.5 mL混勻樣品放入100 mL容量瓶中，加1 mL次亞甲基藍(lán)；定容、靜置1 min，置于血球計(jì)數(shù)板上，用顯微鏡計(jì)量細(xì)胞個(gè)數(shù)，其中，死亡率=染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)[4]。

酸度(酸堿滴定法)測定：于150 mL三角瓶中注入20 mL蒸餾水，加兩滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅色，再吸取過濾醪液1 mL繼續(xù)用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至再次出現(xiàn)粉紅色，在30 s內(nèi)不消失為終點(diǎn)，第2次氫氧化鈉滴定毫升數(shù)乘以10為酸度。

乙醇轉(zhuǎn)化率/%=乙醇濃度/(總糖濃度×0.511)×100%。

掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察：對纖維床固定化酵母先進(jìn)行真空冷凍干燥，然后利用掃描電鏡(model JSM-6010；JEOL Ltd.，Tokyo，Japan)觀察細(xì)胞形態(tài)。游離細(xì)胞離心后加入3.5%的戊二醛，并在4 ℃下保存 15 h，用純水洗2次。用初始濃度為20%、最終濃度為100%、梯度濃度為20%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇進(jìn)行脫水，再用六甲基二硅氮烷進(jìn)一步處理[9]，最后進(jìn)行電鏡掃描。

2 結(jié)果及分析

2.1 細(xì)胞耐受性分析

2.1.1 不同乙醇濃度對游離和固定化細(xì)胞培養(yǎng)的影響 游離和固定化細(xì)胞對不同乙醇?jí)毫ο碌捻憫?yīng)如圖1所示。當(dāng)乙醇濃度在0～4%(體積分?jǐn)?shù))之間時(shí)，兩者葡萄糖在3 h內(nèi)均消耗徹底，糖消耗速率差別不明顯；但固定化酵母細(xì)胞生長速率快于游離細(xì)胞，總細(xì)胞濃度顯著高于后者。隨乙醇濃度增加(8%～16%，體積分?jǐn)?shù))，游離酵母細(xì)胞對葡萄糖的消耗速率逐漸下降。當(dāng)乙醇濃度提高至16%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，游離細(xì)胞培養(yǎng)體系中葡萄糖消耗不完全，而固定化細(xì)胞體系雖然在后期葡萄糖轉(zhuǎn)化速率有變慢現(xiàn)象，但不顯著，且能消耗完全。固定化細(xì)胞生長速率和細(xì)胞濃度依然高于游離細(xì)胞水平。當(dāng)乙醇濃度為16%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，兩者菌體濃度在培養(yǎng)中后期都有明顯的下降趨勢，這可能是因?yàn)楦咭掖紳舛纫种坪蜖I養(yǎng)缺乏，使得酵母開始裂解。當(dāng)初始乙醇濃度設(shè)定到20%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，游離細(xì)胞培養(yǎng)體系的葡萄糖幾乎不被消耗，同時(shí)細(xì)胞濃度一直處于下降趨勢，這說明菌體已趨于死亡；然而固定化細(xì)胞培養(yǎng)體系的葡萄糖呈下降趨勢，雖于27 h時(shí)葡萄糖未被消耗徹底且菌體生長有明顯的抑制現(xiàn)象，但依然能保持較高的酵母活性。結(jié)果表明，基于糖耗及菌體生長現(xiàn)象，固定化酵母細(xì)胞具有較強(qiáng)的乙醇耐受性，而且隨著初始乙醇濃度的提高，兩者的差距也越明顯。

圖1 乙醇對游離及固定化細(xì)胞培養(yǎng)的影響

2.1.2 細(xì)胞形態(tài)分析 圖2為游離及固定化酵母細(xì)胞的掃描電鏡圖，其中圖B、C、D顯示了固定化細(xì)胞形成生物膜過程的3個(gè)時(shí)期：吸附、聚集、成膜。在固定化階段，剛開始細(xì)胞成懸浮狀態(tài)，只有少量細(xì)胞在靜電、氫鍵和范德華等作用力下較弱地吸附在載體上(圖2B)；隨著搖動(dòng)培養(yǎng)，越來越多的細(xì)胞開始聚集(圖2C)；聚集的細(xì)胞形成細(xì)胞層，即所謂的生物膜。生物膜細(xì)胞靠自身產(chǎn)生一種透明的膠狀物質(zhì)，這種膠狀物覆蓋在生物膜之上，緊緊地將生物膜細(xì)胞結(jié)合在一起。不同于固定化細(xì)胞，游離細(xì)胞在電鏡觀察下都成分散狀態(tài)。

A：游離；B：固定化酵母吸附過程；C：聚集過程；D：生物膜形成。

研究發(fā)現(xiàn)，生物膜能提供一種微環(huán)境，這種微環(huán)境有利于誘導(dǎo)抵抗有毒溶劑的基因表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到載體上的細(xì)胞明顯地被一層透明物質(zhì)包埋，即胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)。這種EPS可能是由多糖、蛋白、核苷酸和磷脂等一種或多種物質(zhì)組成[13]。當(dāng)細(xì)胞處于高濃度條件下時(shí)，聚集的細(xì)胞之間通過信號(hào)傳導(dǎo)，誘使與乙醇耐受性相關(guān)的基因表達(dá)，從而產(chǎn)生這種EPS。EPS覆蓋在細(xì)胞表面，通過屏障作用抵抗乙醇的毒害，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的，同時(shí)也促進(jìn)了細(xì)胞增長。當(dāng)固定化的細(xì)胞從載體上釋放出來時(shí)，因?yàn)樯锬け黄茐亩謴?fù)成游離細(xì)胞的生理特性(圖3)。這個(gè)現(xiàn)象也與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[14]。結(jié)果表明，固定化技術(shù)可以促進(jìn)表面細(xì)胞形成生物膜，形成集群效應(yīng)，從而提高對乙醇的耐受性。

F1：第1批的游離細(xì)胞培養(yǎng)；I1：第1批的固定化細(xì)胞培養(yǎng)；F2：第2批游離細(xì)胞培養(yǎng)；I2：第2批固定化細(xì)胞培養(yǎng)；R2：第2批釋放出來的細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2 高濃度乙醇發(fā)酵

2.2.1 單批發(fā)酵對比 由圖4可知，相對于傳統(tǒng)的燃料乙醇發(fā)酵，高濃度乙醇發(fā)酵具有明顯的優(yōu)勢。首先，可以提高設(shè)備利用率。在產(chǎn)量相同的條件下，高濃度乙醇發(fā)酵所占發(fā)酵體積小，減少了對罐體的使用。其次，降低生產(chǎn)能耗。高濃度發(fā)酵中用水量較少，后期乙醇濃度高，降低了分離過程中蒸餾成本[15-16]。此外，高糖度產(chǎn)生的高乙醇濃度可以降低染菌概率，提高生產(chǎn)效率。

基于固定化細(xì)胞的集群效應(yīng)，作者采用水稻液化醪進(jìn)行高濃度乙醇發(fā)酵。如圖4所示，在發(fā)酵初始階段，相比于游離發(fā)酵，固定化發(fā)酵體系殘總糖濃度下降較快。在游離發(fā)酵體系，殘還原糖濃度有一個(gè)明顯上升的過程，且殘還原糖水平偏高，說明相比于固定化發(fā)酵，游離發(fā)酵前期耗糖速率較慢，且明顯滯后于糖化速率。同時(shí)，在固定化發(fā)酵體系，乙醇產(chǎn)量相應(yīng)上升較高。但整個(gè)過程，固定化體系中游離細(xì)胞濃度上升緩慢，總體濃度不高。發(fā)酵至終點(diǎn)時(shí)，游離發(fā)酵殘?zhí)强偺?.97 g/100 mL，殘還原糖1.72 g/100 mL，酒度14.1%(體積分?jǐn)?shù))；而固定化發(fā)酵殘總糖1.58 g/100 mL，殘還原糖0.20 g/100 mL，酒度15.2%(體積分?jǐn)?shù))。另外，從圖5可以明顯觀察到，在固定化發(fā)酵體系中，游離酵母形態(tài)幾乎呈圓形，且被染色的數(shù)量較少；而在游離發(fā)酵體系中，酵母形態(tài)呈拉長的橢圓形，死亡量較多；而且在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，固定化發(fā)酵體系的游離細(xì)胞死亡率在30%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于游離發(fā)酵體系(>78%)，說明固定化發(fā)酵體系的細(xì)胞抗衰老能力明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，固定化細(xì)胞具有較高的群體抗逆性，使得發(fā)酵能力顯著高于游離發(fā)酵，這與我們之前的研究結(jié)果[17-18]較為一致。

A：15%種子的游離細(xì)胞發(fā)酵;B：固定化細(xì)胞發(fā)酵。

圖5 發(fā)酵40 h，游離(A)和固定化細(xì)胞發(fā)酵(B)體系中游離細(xì)胞的形態(tài)

2.2.2 間歇式發(fā)酵的穩(wěn)定性 為了評(píng)估間歇式發(fā)酵在高濃度條件下的穩(wěn)定性，進(jìn)行了9個(gè)批次的間隙式發(fā)酵。如表1所示，固定化發(fā)酵每批游離酵母數(shù)較為穩(wěn)定，在0.7～1.0之間波動(dòng)。殘總糖和還原糖分別在1.74、0.25 g/100 mL左右，變化不顯著。平均乙醇濃度為122.71 g/L，平均酒度達(dá)15.18%(體積分?jǐn)?shù))；總糖平均轉(zhuǎn)化率為93.47%。這些結(jié)果說明，以水稻液化液為發(fā)酵原料進(jìn)行固定化酵母高濃度乙醇發(fā)酵的體系是穩(wěn)定的，其發(fā)酵方式也是可行的。

表1 單批和間隙式發(fā)酵結(jié)果對比

3 結(jié)論

分析了游離和固定化酵母基于糖耗及菌體生長方面的抗乙醇特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酵母表現(xiàn)出較強(qiáng)的乙醇耐受性。游離酵母在乙醇濃度為16%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的抑制現(xiàn)象，而固定化酵母即使在20%(體積分?jǐn)?shù))的高乙醇濃度下依然可以進(jìn)行代謝活動(dòng)。

固定化技術(shù)可以促進(jìn)表面細(xì)胞形成生物膜，形成集群效應(yīng)，提高了對環(huán)境的抗逆性，增強(qiáng)了發(fā)酵能力。與傳統(tǒng)游離發(fā)酵相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵體系反應(yīng)速率明顯加快，且殘總糖水平和細(xì)胞水平明顯低于前者，從而表現(xiàn)為較高的乙醇轉(zhuǎn)化率。

在間歇式發(fā)酵中，固定化發(fā)酵批次之間較為穩(wěn)定，殘總糖水平為1.74 g/100 mL，乙醇濃度為15.18%(體積分?jǐn)?shù))，轉(zhuǎn)化率達(dá)93.47%，比游離發(fā)酵高5.1個(gè)百分點(diǎn)，結(jié)果說明，以水稻液化液為發(fā)酵原料進(jìn)行固定化酵母高濃度乙醇發(fā)酵具有可行性。