王文穎 王秋紅 劉鳴遠(yuǎn) 孫 閻*

（1. 黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2. 哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025）

個(gè)體發(fā)育是有機(jī)體與所處環(huán)境相互作用的過程，這一過程中的胚胎發(fā)育、種子形成、種子萌發(fā)至種苗形成均是處于營養(yǎng)發(fā)育的早期階段［1］，也是植物體根、莖、葉等器官分化的關(guān)鍵時(shí)期，應(yīng)該成為探討系統(tǒng)發(fā)生的重要依據(jù)。胚胎發(fā)育是從一個(gè)受精卵（合子）開始經(jīng)過多次細(xì)胞分裂，反復(fù)分化直至發(fā)育成成熟胚的過程［2］，它是在相對封閉的子房中進(jìn)行的，主要受內(nèi)環(huán)境影響，有利于保存祖先的孑遺原始性狀。種苗發(fā)育是從種子萌發(fā)至幼苗的形成過程，它是在開放的外界環(huán)境中進(jìn)行的，主要受外環(huán)境影響，更多地體現(xiàn)后生性狀。被子植物營養(yǎng)發(fā)育中的胚胎發(fā)育后期至種苗發(fā)育初期［3～5］，即從內(nèi)環(huán)境主導(dǎo)向外環(huán)境主導(dǎo)轉(zhuǎn)換階段，是前人研究工作中最薄弱的環(huán)節(jié)［1，6～9］。就是說在個(gè)體發(fā)育全過程中的這一階段還有一些重要的形態(tài)解剖學(xué)的信息亟待通過研究加以補(bǔ)充，這既是植物結(jié)構(gòu)學(xué)的需要，也是了解植物個(gè)體發(fā)育全貌以及據(jù)此探討系統(tǒng)發(fā)育及生態(tài)演化的需要。

龍膽（Gentiana scabraBunge）又稱粗糙龍膽或龍膽草，為龍膽科（Gentianaceae）多年生草本植物，生于400～1 700 m 海拔的山坡草地、林緣及林下和草甸，見于我國東北、東部沿海和西南地區(qū)［10］。龍膽是黑龍江省優(yōu)質(zhì)地道中藥材“關(guān)龍膽”的重要藥源，以干燥根及根莖入藥，有瀉肝膽實(shí)火，清下焦?jié)駸嶂πВ?1］。近年來，由于過度采挖，分布區(qū)日益縮小，被列為瀕危物種［12］。目前開展了相應(yīng)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究工作［13～14］，尤其是解決了龍膽種子育苗難題（萌發(fā)需要高溫高濕條件）［15］后其栽培規(guī)模逐漸擴(kuò)大，適當(dāng)緩解了龍膽草醫(yī)藥需求壓力。在對龍膽后續(xù)生物學(xué)的研究工作中我們曾發(fā)現(xiàn)其胚后發(fā)育有一些值得注意的特點(diǎn)，如根端發(fā)育滯后，提前產(chǎn)生根環(huán)和根環(huán)毛，以種子萌發(fā)的根尖為材料很難得到好的染色體分裂相等［16～18］。而根端發(fā)育滯后［3，19］、形成根環(huán)和根環(huán)毛是大多水生植物的特點(diǎn)［4，7～8］。為什么陸生植物龍膽會有這種現(xiàn)象？均未見相關(guān)報(bào)道。為此，我們對龍膽合子至種苗的發(fā)育過程進(jìn)行了研究，以進(jìn)一步揭示在器官發(fā)育順序及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上鮮為人知的結(jié)構(gòu)植物學(xué)問題。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料主要采自黑龍江省鶴崗市周邊山區(qū)，經(jīng)哈爾濱師范大學(xué)王臣教授鑒定為龍膽（Gentiana scabra），憑證標(biāo)本（230405180822006LY）保存于黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院植物標(biāo)本室。

用于胚胎發(fā)育時(shí)期的材料，從龍膽的始花期到果期（8月20日～10月8日）進(jìn)行取材，每隔3～5 d取材一次，每次取不同大小的子房各2～4 個(gè)，取材后迅速用FAA（配比：70%酒精90 mL，冰醋酸5 mL，福爾馬林5 mL）固定并及時(shí)對材料進(jìn)行抽氣處理，在固定24 h后轉(zhuǎn)入70%酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

用于種子萌發(fā)觀察的材料在龍膽果實(shí)成熟時(shí)進(jìn)行收集。采集開裂的蒴果20 個(gè)左右（每個(gè)蒴果含種子約2 500 粒），去除雜質(zhì)后的凈種子自然干燥后放置于4℃冰箱保存。

用于電鏡掃描的材料則是取整個(gè)萌發(fā)的種子（種苗）進(jìn)行固定。將材料置于2.5%戊二醛中固定，并緩慢抽氣使材料下沉，之后用0.1% mol·L-1的磷酸緩沖液3次，每次5 min，再經(jīng)梯度濃度乙醇脫水（50%、70%、80%、90%、95%、100%），每一級脫水15 min。隨后用乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥法干燥后獲得樣品材料。干燥的樣品材料用雙面膠粘于樣品臺上，并在離子濺射儀Eiko IB-3 中進(jìn)行導(dǎo)電處理，制成待觀察樣品。

1.2 方法

取一定量的種子置于帶兩層濾紙的培養(yǎng)皿（φ=90 mm）內(nèi)，在室溫條件下進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。借助體視顯微鏡每天觀察種子萌發(fā)狀況后，取不同萌發(fā)過程的種子（種苗）經(jīng)FAA（配比：50%酒精90 mL，冰醋酸5 mL，福爾馬林5 mL）固定24 h 后轉(zhuǎn)入70%酒精內(nèi)保存?zhèn)溆?。同時(shí)將一部分種子直播于帶土的花盆中，觀察種苗發(fā)育形態(tài)特征，并在北京泰克XTS-20體式顯微鏡下拍照。

不同發(fā)育時(shí)期的子房和萌發(fā)的種子材料固定處理后，利用常規(guī)石蠟切片技術(shù)切片，蘇木精整染及番紅復(fù)染，切片厚度8～12 μm。制成的裝片鏡檢后在LEICA-DM 4000 B LED 顯微鏡下觀察拍照。

制備好的電鏡掃描樣品材料最后在HITACHI S-4800 型掃描電子顯微鏡下觀察、拍照和記錄，加速電壓15 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 原胚發(fā)育特征

胚的發(fā)育從合子分裂開始，位于胚囊珠孔端的合子（見圖1：A）近圓形，細(xì)胞核體積較大，位于細(xì)胞中部，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)濃厚。合子經(jīng)歷近3 d的休眠期后才開始有絲分裂，進(jìn)入原胚發(fā)育時(shí)期。合子第一次橫向分裂，產(chǎn)生一個(gè)近珠孔端的體積較大的基細(xì)胞（bc）和一個(gè)近合點(diǎn)端的體積較小的頂細(xì)胞（ac），基細(xì)胞和頂細(xì)胞共同組成2-細(xì)胞原胚（見圖1：B）。之后，基細(xì)胞和頂細(xì)胞再分別進(jìn)行一次橫向分裂，分化為線形排列的4-細(xì)胞原胚（見圖1：C）。4-細(xì)胞原胚形成之后，近合點(diǎn)端的兩個(gè)細(xì)胞又進(jìn)行了一次橫向分裂，形成線形排列的6-細(xì)胞原胚（見圖1：D）。接下來，靠近合點(diǎn)端的兩個(gè)細(xì)胞進(jìn)行斜分裂，形成8-細(xì)胞原胚（見圖1：E）。隨后合點(diǎn)端的4個(gè)細(xì)胞通過多次的平周分裂，原胚體積不斷增大，表皮細(xì)胞分化明顯，發(fā)育為棒形胚（見圖1：F）、球形胚（見圖1：G）。隨著子葉原原基的分化，相繼構(gòu)成了心形胚（見圖1：H）和魚雷胚（見圖1：I）。與此同時(shí)，2-細(xì)胞原胚時(shí)的基細(xì)胞，通過橫向分裂，形成單向排列的3～6 個(gè)胚柄細(xì)胞，與靠珠孔端的大孢子壁相連，其形態(tài)大小在魚雷胚時(shí)變小，呈現(xiàn)出一定的退化趨勢（見圖1：C～J）。因此，胚的發(fā)育模式屬于茄型胚（Solanad type）［20～21］。另一方面，初生胚乳核在2-細(xì)胞和4-細(xì)胞原胚時(shí)期，離原胚較遠(yuǎn)，到了8-細(xì)胞原胚時(shí)，隨著細(xì)胞分裂增殖，以游離核構(gòu)成的胚乳合胞體靠近并包圍初生球形胚，到了球形胚時(shí)期胚乳細(xì)胞分化出明顯的細(xì)胞壁，形成了胚乳細(xì)胞（見圖1：G），因此，發(fā)育模式符合核型胚乳［20～21］。到了心形胚和魚雷胚階段，原胚周圍的胚乳細(xì)胞被逐步吸收，原胚和胚乳體之間形成一圈明顯的空隙，沒有觀察到胚乳吸器（見圖1：H～J）。

種子自開裂蒴果散落時(shí)，種子胚的分化不完全，大部分處于魚雷胚時(shí)期，胚乳細(xì)胞中也積累較多的內(nèi)含物，此時(shí)胚周圍的部分胚乳細(xì)胞解體（見圖1：I），被胚所吸收。

2.2 種子萌發(fā)及器官分化過程

龍膽種子萌發(fā)前經(jīng)過形態(tài)后熟發(fā)育至成熟胚時(shí)期，其種子室溫浸水2 d 后，首先是胚體周圍胚乳逐漸水解成可吸收的液態(tài)（見圖2：A）；胚體吸收周圍的養(yǎng)分繼而兩片子葉逐漸加厚，長成長橢圓形，胚軸伸長，根端也開始分化（見圖2：B～C），此階段胚芽也未見發(fā)育（見圖2：B～C）。至第五天時(shí)可見胚根從種皮外的翅中伸出，主要是由下胚軸細(xì)胞持續(xù)生長使胚根的根端自種孔突破種皮，根端初步分化（見圖2：D）。胚根突破種皮后，在胚根和下胚軸的交界位置，接近下胚軸末端的細(xì)胞向外膨大形成一個(gè)環(huán)狀凸起，即根環(huán)（root collar）（見圖2：D～E）。隨后根環(huán)區(qū)域細(xì)胞外凸形成根環(huán)毛（collet hairs），在縱軸上可見根環(huán)毛由根環(huán)處的2～5 層表皮細(xì)胞外凸發(fā)育而成（見圖2：F～I(xiàn)），其長度逐漸超過胚根（見圖3：C～E）。這圈毛發(fā)生時(shí)可見胚根的根尖并未完全發(fā)育，明顯早于根毛的發(fā)育，所以不是根毛結(jié)構(gòu)，因其由根環(huán)的表皮細(xì)胞外凸形成，故稱之為根環(huán)毛，亦稱下胚軸毛。根環(huán)毛較為密集，其細(xì)胞核常位于基部至中部（見圖2：H），這也與根毛完全不同，但根環(huán)毛在外形上與根毛類似（見圖2：J），均是表皮細(xì)胞外凸形成的管狀結(jié)構(gòu)。

種苗子葉脫離種皮時(shí)，根環(huán)處的根環(huán)毛較為密集，包圍著胚根，并且長度甚至超過胚根，胚根先端雖然主要為分生細(xì)胞組成，但尚未見根尖分生區(qū)明顯分化。這些密集的根環(huán)毛常常伸入周圍介質(zhì)中，明顯起到固定種苗的作用，這也使得平臥的種苗逐漸轉(zhuǎn)為直立狀態(tài)進(jìn)行生長，此時(shí)根端的分生區(qū)細(xì)胞開始分化，正常根毛出現(xiàn)（見圖2：J）。

為了進(jìn)一步了解龍膽的種子萌發(fā)形態(tài)學(xué)特征，利用掃描電鏡觀察了它們的萌發(fā)過程，結(jié)果如下。浸水第5 天可見下胚軸伸長使胚根突破種皮（見圖3：A），根端初步分化，并在下胚軸和胚根交界處出現(xiàn)呈環(huán)狀膨大的根環(huán)（見圖3：B，F(xiàn)），隨后根環(huán)處的表皮細(xì)胞外凸延長形成管狀的根環(huán)毛（見圖3：C～D，G），多而密集的根環(huán)毛包圍圓錐狀的胚根，此階段的胚根初步發(fā)育，其長度的增加主要靠分生區(qū)細(xì)胞數(shù)量增多來實(shí)現(xiàn)的，先端可見根冠結(jié)構(gòu)。隨著種苗的進(jìn)一步發(fā)育，胚根發(fā)育較快，其內(nèi)部成熟組織出現(xiàn)，成熟區(qū)正常發(fā)育的根毛出現(xiàn)，此時(shí)的根環(huán)毛依舊保存完好（見圖3：E，H）。幼苗的根環(huán)毛剛出現(xiàn)后，子葉上的氣孔也逐漸發(fā)育可見（見圖3：I）。

子葉展開變綠時(shí)，也未見胚芽發(fā)育，但根發(fā)育較快（見圖4：A）。至第一對真葉可見時(shí)（見圖4：B），子葉狀態(tài)的種苗已經(jīng)停留10 d有余，但其地下的胚根則持續(xù)生長，說明其苗端發(fā)育相對停滯。但在地上停滯發(fā)育的同時(shí)，地下的胚根（主根）在根端分生組織的作用下逐漸伸長，隨著正常根毛的出現(xiàn)，根環(huán)毛也逐漸萎縮（退化）（見圖4：A）。

3 討論

龍膽胚和胚乳的發(fā)育過程與已報(bào)道的龍膽屬（Gentiana（Tourn.）L.）胚胎學(xué)特征基本一致［22～24］，如種子含豐富的胚乳，胚乳發(fā)育為核型，胚的發(fā)育為茄型等。但是龍膽4-細(xì)胞原胚時(shí)期之后的第三次分裂不是4個(gè)細(xì)胞全部橫裂，而只有來源于頂細(xì)胞的兩個(gè)細(xì)胞進(jìn)行橫裂，形成6-細(xì)胞原胚（見圖1：D）。這與龍膽屬的東北龍膽［22］、秦艽［25］、線葉龍膽［23］、以及條紋龍膽［24］相似，而與黑邊假龍膽［26］、喉毛花［27］和濕生扁蕾［28］不同，后三種植物的4-細(xì)胞原胚第三次分裂是4 個(gè)細(xì)胞全部橫裂形成8-細(xì)胞原胚。這樣的發(fā)育特性是否具有系統(tǒng)學(xué)意義，有待進(jìn)一步研究評價(jià)［29］。

另外，龍膽種子離開母體時(shí)胚體的發(fā)育程度并不是球形胚階段，主要是心形胚和魚雷胚時(shí)期，因此，前人總結(jié)的龍膽屬胚胎學(xué)特征中關(guān)于“當(dāng)種子散落時(shí)胚只發(fā)育至球形胚階段”［23］這一特點(diǎn)應(yīng)該擴(kuò)展至心形胚和魚雷胚階段。也就是說龍膽種子成熟時(shí)，其胚芽和胚根尚未分化，萌發(fā)前的種子其胚體需要進(jìn)行形態(tài)后熟過程，豐富的胚乳中的內(nèi)含物是這一過程完成的有利保障。

植物的根環(huán)和根環(huán)毛是最初在研究龍膽時(shí)發(fā)現(xiàn)的，主要是種子在地面萌發(fā)后看見的，但當(dāng)時(shí)未對下胚軸末端這一環(huán)狀分布的長而密的毛給予重視，后來在根系發(fā)生與發(fā)展的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)這圈毛在一些種類中也存在。隨后查閱文獻(xiàn)獲知，根環(huán)和根環(huán)毛在水、濕環(huán)境中的被子植物中是比較常見的原始性狀，如芡實(shí)［1］、澤瀉［3］、大花睡蓮［7］、慈姑［19］和龍舌草［30］等。并且這圈毛最初被誤認(rèn)為是“根毛”［31］，后來根據(jù)其出現(xiàn)的時(shí)間和位置被界定為“下胚軸毛”［19，32］，而這圈毛是根環(huán)細(xì)胞外凸形成，根據(jù)根環(huán)的位置和已有研究報(bào)道［8，33～34］，今后稱之為“根環(huán)毛”將更為準(zhǔn)確。也就是說水生被子植物種子萌發(fā)時(shí)一般都是在下胚軸末端產(chǎn)生根環(huán)和根環(huán)毛，并且苗端先發(fā)育，根端后發(fā)育，這些性狀應(yīng)該可以作為判斷水生起源的特征組，是原始的遺傳性狀。正如陸生哺乳動物胚胎發(fā)育中出現(xiàn)的鰓裂，在演化上意味著其祖先曾經(jīng)是水生的，而成體未見鰓裂并不等于它在系統(tǒng)發(fā)育中一直是陸生的，通過個(gè)體發(fā)育全面系統(tǒng)的研究，仍可根據(jù)早期出現(xiàn)的鰓裂作出判斷，在系統(tǒng)發(fā)生上先是水生，而陸生是后來發(fā)生的?？磥恚辽僭谏鲜鰝€(gè)例的某些性狀上，被子植物營養(yǎng)發(fā)育也有重復(fù)系統(tǒng)發(fā)育的表現(xiàn)。另外，根環(huán)和根環(huán)毛的發(fā)育也是受特定基因調(diào)控的，其出現(xiàn)的密度和長度顯然更利于種苗初期固定于泥土之上，也使得種苗由平臥變?yōu)橹绷⑸L。根環(huán)毛的細(xì)胞核通常位于毛的基部至中部，似乎是個(gè)動態(tài)變化的過程，其是否具有類似于根毛的吸收作用，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

龍膽自然分布于山坡草地、灌叢中、林緣及林下、草甸等，是偏旱的自然生態(tài)環(huán)境。其種子地面萌發(fā)，需要高溫高濕的環(huán)境，并且萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生根環(huán)和根環(huán)毛以及蓮座狀的種苗適當(dāng)耐水淹等，這些特點(diǎn)皆與水環(huán)境密切相關(guān)，應(yīng)該是水生祖先孑遺性狀得以保留的表型特征，并不是簡單的適應(yīng)性狀。龍膽的種子在成熟胚階段胚根的根端已初步分化，而苗端未見分化；種苗發(fā)育中根端入土發(fā)育成初生根，初生根產(chǎn)生分枝后，才有真葉的產(chǎn)生；幼苗無通氣組織，具完整的輸導(dǎo)組織，具氣孔和明顯加厚的角質(zhì)層等，這些性狀顯然又反映其對現(xiàn)代偏旱環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā)展。總之，從生態(tài)演化的觀點(diǎn)來看，龍膽的早期營養(yǎng)發(fā)育，既反映其祖先的水生孑遺原始性狀，又反映了對現(xiàn)存偏旱生境的適應(yīng)，它應(yīng)該是水生起源的，是次生陸生的進(jìn)一步演化。