焦 驕 劉 婧 付玉杰 王 馨 蓋慶巖 鹿 瑤 徐曉杰 王紫瑩

（東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院，森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

紅豆杉（Taxusspp.）又稱紫杉是紫杉科（Taxaeae）紅豆杉屬（Taxus）的常綠喬木慢生樹種，作為古老的第四紀冰川遺種，在地球上擁有悠久的演化歷史［1］。眾所周知，紅豆杉中特有的紫杉醇活性成分對卵巢癌、前列腺癌、食管癌、人肝癌、頭頸部腫瘤及惡性淋巴瘤等具有顯著的治療效果［2］。據報道，一棵百年樹齡的紅豆杉僅能獲取300 mg 左右的紫杉醇，但是治療一個癌癥病人通常需要2.5～3 g 的紫杉醇，以此推算則需消耗8 棵左右百年樹齡的紅豆杉［3～4］。據此，紫杉醇的強勁市場需求已對紅豆杉資源產生了巨大的破壞。此外，天然紅豆杉結實率低，種子萌發(fā)周期長且出芽率低，同時紅豆杉自然生長極其緩慢，再加上人類的過度開發(fā)利用已造成其野生資源瀕臨枯竭，全球范圍內多個國家已將其列為珍稀瀕危保護物種［5～6］。

近些年來，植物組培快繁技術已成為對瀕危物種進行高效繁育、保護和可持續(xù)利用的有效手段，也是當前植物學研究的熱點和重點領域［7］。植物組培快繁技術是依托于細胞全能特性，通過無菌操作和適宜的培養(yǎng)條件，在短時間內誘導植物原生質體、細胞、組織及器官等啟動、增殖和生根，最終獲得遺傳性質穩(wěn)定均一的完整植株的技術，具有培養(yǎng)周期短、繁殖系數高、不受季節(jié)限制、方便選育新品種等優(yōu)點，尤其在繁育保護稀缺植物種質資源方面具有顯著優(yōu)勢［8～9］，如水杉、天目鐵木、崖柏、海倫兜蘭等極小種群瀕危植物［10～13］。就紅豆杉而言，已有多項研究報道嘗試利用其莖和葉等外植體脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織分化形成不定芽，遺憾的是這種方法在愈傷組織誘導、繼代和再分化過程中極易出現褐化死亡現象，最終未能形成一種有效組培繁育技術體系［14～16］。除此之外，還有研究者嘗試利用南方紅豆杉成熟胚為外植體進行組培擴繁研究，但是結果發(fā)現該方法培養(yǎng)周期過長，操作過程繁瑣且效率低下［17～18］。因此，亟需開發(fā)一種可靠的離體組培繁育技術體系，以期實現對紅豆杉這一瀕危種質資源進行有效保護，進而可保證紅豆杉產業(yè)良性健康發(fā)展。

本文以我國特有的3 種紅豆杉（東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉）為研究對象，采用莖段腋芽啟動組培技術對這3 種紅豆杉進行繁育研究。選取上述3 種紅豆杉帶有腋芽的莖段組織為外植體，系統(tǒng)考察了腋芽啟動、增殖和生根培養(yǎng)過程中所需植物激素組合，以期建立一種或幾種簡單有效的紅豆杉繁育技術體系，為我國紅豆杉種質資源的保護和可持續(xù)利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室實驗園中生長狀態(tài)良好的3種紅豆杉（東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉）為實驗對象。選取每種紅豆杉生長旺盛部位的嫩枝前段帶腋芽的莖段組織（6～8 cm）為供試材料。

1.2 材料的消毒處理

經過多次預試驗，我們確定了最優(yōu)的外植體消毒方法，具體操作過程如下：將帶腋芽的3 種紅豆杉莖段供試材料用自來水持續(xù)沖洗4 h，在超凈工作臺中用75%乙醇溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用4%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗3 次，用無菌濾紙吸干莖段表面水分，剝去莖段外面的幼葉，再將莖段組織切割為帶有2～3 個腋芽的外植體（2 cm左右），待接種。

1.3 培養(yǎng)基的配制

以MS 和WPM 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，配制添加有不同種類和不同濃度植物生長激素（6-BA、NAA 和IBA）的實驗培養(yǎng)基。具體如下：在MS 培養(yǎng)基的基礎上，分別添加細胞分裂素6-BA（0.1～1.0 mg·L-1）和生長素NAA（0.1～1.0 mg·L-1），按照實驗設計［如圖1（A）和圖2（A）所示植物激素組合］配制成11 種啟動和增殖培養(yǎng)基；在WPM 培養(yǎng)基的基礎上，分別添加生長素NAA（0.1～1.0 mg·L-1）和IBA（0.1～1.0 mg·L-1），按照實驗設計［如圖3（A）所示植物激素組合］配制成11 種生根培養(yǎng)基。上述每種培養(yǎng)基中均加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂8 g·L-1，并調節(jié)培養(yǎng)基初始pH 值為5.80±0.05，然后在0.1 MPa壓強和121℃下高溫滅菌20 min。

1.4 莖段腋芽啟動培養(yǎng)

將帶有2～3 個腋芽的3 種紅豆杉莖段外植體接種到上述含有植物激素（6-BA 和NAA）的11 種MS 啟動培養(yǎng)基上，置于溫度25±2℃、光照強度2 000 lx、光周期16 h·d-1的條件下進行培養(yǎng)。每個啟動培養(yǎng)基內接種3～4 個帶腋芽的莖段外植體，每種紅豆杉樣品做6 個重復。經過30 d 的啟動培養(yǎng)，觀察并統(tǒng)計不同紅豆杉種類莖段外植體上腋芽點的萌動和生長情況。

1.5 增殖繼代培養(yǎng)

待啟動后的腋芽長到2～3 cm，在超凈工作臺中將其切割下來，轉接到上述含有植物激素（6-BA和NAA）的11 種MS 培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。每個增殖培養(yǎng)基內接種2～3 個不定芽，每種紅豆杉樣品做6 個重復，培養(yǎng)溫度、光照強度和光周期等其他培養(yǎng)條件如1.4 中所述，在60 d 左右的生長期內觀察腋芽的增殖生長狀況，觀察并統(tǒng)計不同種類紅豆杉新生不定芽點的萌發(fā)數量。

1.6 生根培養(yǎng)

選取增殖培養(yǎng)后長勢較好的不定芽（高度5～6 cm），將其轉接到上述含有植物激素（NAA 和IBA）的11 種WPM 培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。每個生根培養(yǎng)基內接種1～3 個不定芽，每種紅豆杉樣品做20～30 個重復，培養(yǎng)溫度、光照強度和光周期等其他培養(yǎng)條件如1.4 中所述，在90 d 左右的生長期內觀察不定芽根部生長狀況，觀察并統(tǒng)計不同種類紅豆杉不定芽的生根數量。

1.7 數據統(tǒng)計

本實驗中涉及的數據和圖表均用Microsoft Office Excel 2010 程序處理。SPSS 19.0 軟件被用于統(tǒng)計分析，并通過單變量方差分析在P＜0.05 的水平進行顯著性差異分析。此外，本項研究目的在于建立3 種紅豆杉莖段腋芽啟動組培繁育技術體系，所以對于莖段腋芽啟動率和增殖系數的統(tǒng)計和計算是基于所有紅豆杉腋芽和不定芽的接種個數。由于生根實驗中，只有東北紅豆杉不定芽可以生根，所以生根率的統(tǒng)計和計算是基于東北紅豆杉不定芽的接種個數。

2 結果與分析

2.1 不同植物激素組合對3種紅豆杉莖段腋芽啟動生長的影響

如圖1（A）所示，帶腋芽的莖段在添加固定濃度生長素NAA（1.0 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基中，隨著細胞分裂素6-BA 的濃度從0.1 mg·L-1增加到1.0 mg·L-1，其啟動率逐漸從2.83%升高到43.08%；當MS 培養(yǎng)基中6-BA 的濃度固定為1.0 mg·L-1，隨著NAA 的濃度從1.0 mg·L-1減少到0.1 mg·L-1，莖段腋芽的啟動率逐漸從45.92%升高到97.07%，并確定MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 為3 種紅豆杉莖段腋芽啟動的最佳培養(yǎng)基。如圖1B 所示，將3 種紅豆杉帶腋芽的莖段外植體接種在上述最佳啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 天，均可高效促使腋芽的萌動和生長。

2.2 不同植物激素組合對于3種紅豆杉不定芽增殖的影響

啟動后的紅豆杉腋芽需要經過增殖培養(yǎng)來進行擴繁，我們將上一步成功啟動的3種紅豆杉腋芽從外植體上切割后轉移到增殖培養(yǎng)基上進行擴增。如圖2A 所示，當培養(yǎng)基中細胞分裂素6-BA的濃度固定為1.0 mg·L-1，隨著生長素NAA 的濃度從0.1 mg·L-1增加到1.0 mg·L-1，紅豆杉不定芽的增殖系數從0 升高到2.83；而當培養(yǎng)基中NAA 的濃度固定為1.0 mg·L-1，其增殖系數在6-BA濃度為0.4 mg·L-1時可達到最高為3.18。因此，本研究選取MS+0.4 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA 為3 種紅豆杉不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基。如圖2B 所示，將啟動后的3 種紅豆杉腋芽接種在上述最佳增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d，均可有效促進新的不定芽的出現和生長。

2.3 不同植物激素組合對3種紅豆杉不定芽生根的影響

只有生根的紅豆杉不定芽才是一個完整的植株，我們將上一步成功增殖的3種紅豆杉不定芽切割后轉移到生根培養(yǎng)基上進行誘導生根。在本實驗研究的植物激素種類的濃度范圍內，我們發(fā)現南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉均未能出現生根，只有東北紅豆杉可以有效生根。具體實驗結果如圖3A 所示，東北紅豆杉不定芽在添加單一生長素（1.0 mg·L-1NAA 或1.0 mg·L-1IBA）的WPM 培養(yǎng)基中生根率差別顯著，添加NAA 比添加IBA 的生根率提高了將近5倍；在兩種生長素組合的培養(yǎng)基中，生根效果最佳的是添加0.8 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA 的培養(yǎng)基，比單一添加1.0 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基生根率更高，可達8.15%，單個不定芽平均生根3條，且主根長度在3.0～3.5 cm。因此，本實驗選定WPM+0.8 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA 為誘導東北紅豆杉不定芽生根的最佳培養(yǎng)基。此外，我們發(fā)現紅豆杉在生根過程中，其根上部分容易出現葉片脫落枯萎的現象。因此，我們將生根后的紅豆杉不定芽轉移到不含任何植物激素的WPM 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可實現其有效生長。如圖3B 所示，將增殖后的東北紅豆杉不定芽接種在上述最佳生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)90 天，可有效誘導不定芽生根但不利于根上部位生長，轉移到不含植物激素的培養(yǎng)基中，紅豆杉莖葉生長狀態(tài)可有效恢復且主側根根系發(fā)達。

3 討論

植物組織或器官在離體培養(yǎng)條件下往往缺乏合成細胞分裂素和生長素的能力［19，20］，為了在植物組織培養(yǎng)體系中實現細胞分裂、生長、形態(tài)分化等效果，需要在外植體生長、不定芽增殖、生根等階段的培養(yǎng)基中添加不同種類、濃度和配比的植物生長素和細胞分裂素。根據以往的研究報道，細胞分裂素6-BA 和植物生長素NAA 對于植物不定芽的啟動和增殖具有較好的效果［21］。因此，在本項研究工作中，我們選取了這兩種植物激素進行不同濃度組合，以期實現對紅豆杉腋芽的有效啟動和增殖。此外，我們前期的預實驗表明在MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA 和NAA 可實現3 種紅豆杉腋芽的啟動和增殖，而WPM 培養(yǎng)基則有利于紅豆杉不定芽的生根和后續(xù)無激素生長。因此，我們選定MS 培養(yǎng)基為紅豆杉腋芽啟動和增殖的基本培養(yǎng)基。WPM 培養(yǎng)基為誘導紅豆杉不定芽生根的基本培養(yǎng)基。

植物枝條在向上生長過程中具有較強的頂端優(yōu)勢，其自身合成的天然生長素大量積累在側芽，使得側芽生長緩慢或休眠不生長。如圖1A 所示，當培養(yǎng)基添加固定較高濃度的NAA 時，莖段外植體上腋芽的啟動率隨著6-BA 濃度的逐漸增加而升高；當培養(yǎng)基中添加固定較高濃度的6-BA 時，莖段外植體上腋芽的啟動率隨著NAA的濃度逐漸降低而顯著升高。以上實驗結果表明降低生長素NAA 濃度并且相對提高細胞分裂素6-BA 濃度有利于解除莖段頂端優(yōu)勢對腋芽生長的限制，可有效促進腋芽的啟動生長。李慧等人在研究不同激素對銀白楊葉片不定芽再生的影響中發(fā)現，當MS培養(yǎng)基中6-BA 和NAA 的濃度比為5∶1 時對于不定芽的誘導效果最佳，但隨著NAA 的濃度繼續(xù)升高時，誘導率則隨之下降［22］，這與本實驗研究結果較為一致。

莖段腋芽啟動培養(yǎng)后，需要對所得不定芽進行增殖培養(yǎng)，以進一步擴大其數量和規(guī)模，以期實現有效擴繁。本研究發(fā)現，較高濃度的生長素有利于不定芽增殖，且在MS 培養(yǎng)基中添加一定濃度的細胞分裂素（0.4 mg·L-16-BA）對紅豆杉不定芽增殖效果最佳。我們推測，在不定芽增殖培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中高濃度的NAA可起到抑制頂端生長的作用（如圖2B 中東北紅豆杉和南方紅豆杉主芽出現了枯萎的現象），而一定濃度的細胞分裂素可促進不定芽的發(fā)生，進而實現良好的增殖效果。孫珺等人在紅豆杉愈傷組織的誘導培養(yǎng)的研究中發(fā)現，在1/2 MS 基本培養(yǎng)基的條件下，保持6-BA 濃度不變，且在一定濃度范圍內，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織的增殖率也隨之上升［23］，這和本實驗研究結果較為一致。王冰等在研究東北紅豆杉快繁技術時發(fā)現，培養(yǎng)基中生長素NAA 與高濃度的細胞分裂素6-BA 配比時其芽分化及生長的情況相對較好［24］。楊玲等在摸索云南紅豆杉枝條離體快繁技術時發(fā)現，在含有2.0～3.0 mg·L-16-BA+1.0～2.0 mg·L-1IBA 或1.0～2.0 mg·L-1NAA 的B5 培養(yǎng)基上，芽可形成長勢較好的枝條［25］。此外，師春娟和劉新星等概述了近年來針對紅豆杉屬植物主要的組織培養(yǎng)方法及其影響因素的研究成果，發(fā)現紅豆杉屬植物的組織培養(yǎng)方法不同于其它木本植物，不同的種類、培養(yǎng)材料、甚至同一品種的不同部位采用的培養(yǎng)基往往不相同。因此，目前紅豆杉的離體組織培養(yǎng)條件沒有統(tǒng)一的標準，紅豆杉的組培繁育需要根據不同的目的、材料和方法相應地調整培養(yǎng)措施［26～27］。

不定芽成功增殖后，我們需要對不定芽進行生根培養(yǎng)，只有生根的不定芽才是完整的植株，才能有效實現紅豆杉組培苗的繁育和栽培。相關研究表明，NAA 和IBA 對紅豆杉不定芽生根均具有顯著的促進作用［28～29］。在本實驗研究的NAA 和IBA 濃度范圍內，在一定時間的誘導期內（60～120天）我們發(fā)現只有東北紅豆杉不定芽可以有效生根，而南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉不定芽沒有出現生根現象，這可能與不同種類紅豆杉固有的內在遺傳物質差異有關，進而使得各自驅動根形態(tài)發(fā)育建成所需植物激素種類和濃度以及所需培養(yǎng)時間不同所致。在后續(xù)研究中，我們將嘗試更換植物激素類型和濃度或進一步延長培養(yǎng)時間，以期實現南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉不定芽生根。同時，本研究還發(fā)現這兩種生長素的組合比任何單一種類的生長素對誘導東北紅豆杉不定芽生根效果要好，這可能與這兩種激素在誘導生根時可發(fā)揮協(xié)同互補作用有關。此外，東北紅豆杉誘導生根過程中出現了葉片脫落枯萎的現象，這可能歸因于：不定芽生根后其自身合成植物激素的能力隨之增強，而培養(yǎng)基中仍含有過高濃度的生長素，二者協(xié)同起來會對生根苗的生長產生抑制作用，進而導致葉片脫落枯萎。為了解決這一問題，我們將生根苗在后續(xù)培養(yǎng)過程中轉移到不添加任何激素的WPM 培養(yǎng)基中，以此來消除過高植物激素對其生長引起的不利影響，事實也證明了這種舉措確實產生了良好的效果，這體現了低濃度生長素促進植物生長而高濃度生長素抑制植物生長的雙重性作用［30］。

4 結論

本研究選用我國特有的東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉的帶有腋芽的莖段組織為外植體，系統(tǒng)考察了其啟動、增殖及生根過程中涉及的培養(yǎng)條件，在不同植物激素組合的啟動培養(yǎng)基中確定了MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 為3種紅豆杉腋芽的啟動培養(yǎng)基；在不同植物激素組合的增殖培養(yǎng)基中確定了MS+0.4 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA 為3 種紅豆杉不定芽的增殖培養(yǎng)基；在不同植物激素組合的生根培養(yǎng)基中確定了WPM+0.8 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA 為東北紅豆杉不定芽的生根培養(yǎng)基，且不含任何植物激素的WPM 培養(yǎng)基為生根苗的最佳生長培養(yǎng)基。本項研究所建立的紅豆杉莖段腋芽啟動組培繁育技術操作簡單、有效可靠、成本低且不受季節(jié)限制，可為我國紅豆杉種質資源的保護和可持續(xù)利用提供有力的技術支撐。未來將致力于解決南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉不定芽不生根的問題以及進一步提高這3 種紅豆杉不定芽的增殖率和東北紅豆杉的生根率，最終建立一整套高效的紅豆杉繁育技術體系，以期實現我國紅豆杉繁育相關產業(yè)的健康快速發(fā)展。