樸勇洙，張京，王欣波，任慧，齊堉潼，朱彬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

白塞氏病(Behcet's disease,BD)是以葡萄膜炎和結(jié)節(jié)性紅斑、生殖器潰瘍、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍?yōu)橹饕R床特征, 并可累及胃腸道、心血管、神經(jīng)、血液等多系統(tǒng)損傷的慢性多系統(tǒng)血管炎。本病屬于免疫功能紊亂性疾病，患者往往對外界病原體的免疫反應(yīng)減弱，但是對于自身器官組織的免疫反應(yīng)卻表現(xiàn)為亢進(jìn)?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)治療手段主要以服用非甾體抗炎藥、免疫制劑、糖皮質(zhì)激素, 但是因其停藥易再次發(fā)作，西醫(yī)無法徹底根除, 而中醫(yī)運(yùn)用中醫(yī)藥為治療手段取得較好的臨床療效。非甾體抗炎藥作為臨床上治療白塞氏病的藥物之一, 因患者長期服用而導(dǎo)致機(jī)體對該藥耐藥性的產(chǎn)生，是治療失敗的主要原因[1]。因此, 探索白塞氏病耐藥性的分子調(diào)控機(jī)制, 尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)可為提高白塞氏病治療效果產(chǎn)生積極影響。由于長期運(yùn)用三物黃芩湯治療白塞氏病患者效果顯著，為求進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，設(shè)計(jì)課題研究三物黃芩湯對白塞氏病小鼠外周血炎癥因子及相關(guān)蛋白的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取雌性清潔級4～6周齡的BALB/c小鼠，體質(zhì)量(25±2)g，在室溫(22±2)℃，相對濕度55%～60%，安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。自由攝食，給予充足清潔飲水。

1.2 藥材及制備

三物黃芩湯草藥黃芩6 g，苦參6 g，生地黃12 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 主要儀器

水平搖床(WD-9405B)；電泳儀(DYY-7C)；轉(zhuǎn)移槽(DYCZ-40D)；雙垂直蛋白電泳儀(DYCZ-24DN)；凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B型，北京六一)。微量移液器(Proline，蘇州BIOHIT公司)；超純水系統(tǒng)(NW10LVF，香港Heal Force公司)；超速冷凍離心機(jī)(H-2050R ，長沙湖南湘儀公司)；酶標(biāo)儀(ELX-800，美國BIOTEK公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH36001B，天津泰斯特公司)；倒置相差顯微鏡(型號IX53，日本OLYMPUS公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號HF-90,中國上海力申公司)；超凈工作臺(型號SW-CJ-2FD,中國蘇州蘇凈安泰公司)。

1.4 主要試劑

全蛋白提取試劑盒(WLA019)；全蛋白提取試劑盒(WLA019)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(WLA004)；SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒(WLA013)；Western洗滌液(WLA025)；SDS - PAGE電泳液(干粉)(WLA026)；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(WLA005)；ECL發(fā)光液(WLA003)；p-STAT3(WLP2412)；STAT3(WL03207)；羊抗兔IgG-HRP(WLA023)；內(nèi)參抗體 β-actin(WL01845，中國wanleibio公司)，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(26616,加拿大Fermentas公司)；PVDF膜(IPVH00010,美國Millipore公司)；BSABS043(中國Biosharp公司)；脫脂奶粉(Q/NYLB 0039S,中國伊利公司)。小鼠外周淋巴細(xì)胞分離液試劑盒(產(chǎn)品編號P8620，中國索萊寶公司)；IFN-γELISA檢測試劑盒(產(chǎn)品編號SEA049Mu，中國武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)；沙利度胺(產(chǎn)品編號T126856)、ionomycin(產(chǎn)品編號I139530，中國阿拉丁公司)；PBS(產(chǎn)品編號P10033，中國雙螺旋公司)；CD4-FITC(產(chǎn)品編號11-0042-81)、IFN-γ-PE(產(chǎn)品編號12-7311-81)，(美國eBioscience公司)；PMA(產(chǎn)品編號HY-18739，美國MCE公司)；BrefeldinA(產(chǎn)品編號HY-16592，中國Aladdin公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 過敏原制作

取中國對蝦蝦肉，去除其頭、尾、蝦線。蝦肉被置于緩沖液A(50 mmol/L KCl、2 mmol/L NaHCO3)溶液中，充分勻漿，4 ℃離心取沉淀，重復(fù)操作4次。預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀，攪拌，將蝦肉中殘留的丙酮充分揮發(fā)。制備好的蝦肌肉丙酮粉被置于緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl、1 mol/L KCl、0.1 mmol/L DTT)中抽提過夜，4 ℃離心取上清。調(diào)節(jié)上清液的pH至4.5，并緩慢加入40%(NH4)2SO4溶液，充分?jǐn)嚢瑁? ℃離心取沉淀；取上清液再次加入40%(NH4)2SO4溶液，充分?jǐn)嚢瑁? ℃離心取沉淀。用緩沖液B分別溶解上述2次沉淀，沸水浴加熱10 min，冰上迅速冷卻，4 ℃離心，取其上清，得到提取中國對蝦原肌球蛋白液。將提取的中國對蝦原肌球蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白純度鑒定，將蛋白分裝保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 模型制作

BALB/c小鼠60只，分為空白組、模型組、沙利度胺組、三物黃芩湯各劑量組，每組10只。各組小鼠生活環(huán)境為12 h白12 h黑，溫度(22±1)℃，濕度45%～55%，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后再建立模型，除空白組外，剩余各組小鼠于第7、14、21、28天腹腔注射(0.1 mL的弗氏佐劑和0.1 mL 12 mg/mL對蝦原肌球蛋白)濃度為6 mg/mL的過敏原，建立小鼠白塞氏病模型。

2.3 實(shí)驗(yàn)動物給藥

空白組小鼠給予同等體積的生理鹽水。沙利度胺組小鼠于第28天后腹腔注射75 mg/kg沙利度胺，1次/日，持續(xù)到第56天。三物黃芩湯低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組小鼠，1次/日灌胃三物黃芩湯(低劑量：1 g/kg、中劑量2 g/kg、高劑量4 g/kg)。模型組、沙利度胺組、三物黃芩湯低劑量治療組、三物黃芩湯中劑量治療組、三物黃芩湯高劑量治療組小鼠在第56天腹腔注射0.4 mL濃度為6 mg/mL的過敏原致敏激發(fā)。末次腹腔注射激發(fā)2 h后，摘眼取血一部分加肝素抗凝，一部分分離血清后儲存于-70 ℃超低溫冰箱，收集脾臟組織液氮凍存后轉(zhuǎn)入-70 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 外周血單核細(xì)胞的分離

向管內(nèi)加入外周血，搖勻，再加入等體積室溫PBS稀釋血液。向15 mL離心管內(nèi)放入等體積淋巴細(xì)胞分離液，傾斜試管，將稀釋后的血液沿試管壁緩慢加至分層液上面。將離心管置于水平式離心機(jī)內(nèi)，18～20 ℃，2 000 rpm離心20 min。離心后，將吸管輕輕的插入灰白色層，小心的吸出PBMC。 轉(zhuǎn)入干凈離心管內(nèi)，PBS清洗細(xì)胞2次。棄上清，以后續(xù)試驗(yàn)所需相應(yīng)液體質(zhì)量懸細(xì)胞。

2.5 Western印跡法檢測STAT3及P-STAT3蛋白的表達(dá)

Western blot檢測脾臟組織中STAT3及P-STAT3蛋白表達(dá)水平收集STAT3及P-STAT3，用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，用Western blot檢測STAT3及P-STAT3蛋白表達(dá)水平，取40 μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉后加入一抗(β-actin antibody 1∶1 000，STAT3 1∶500，P-STAT3 1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，加HRP標(biāo)記二抗(β-actin antibody 1∶5 000，STAT3 1∶5 000，P-STAT3 1∶5 000)，孵育 1h，最后利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色，在暗室曝光，凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值，以觀察各組STAT3及P-STAT3蛋白表達(dá)水平。

2.6 相關(guān)炎癥因子標(biāo)本采集及檢測

將IFN-γ4 000 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1 000 pg/mL。稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：1 000 pg/mL，500 pg/mL，250 pg/mL，125 pg/mL，62.5 pg/mL，31.2 pg/mL，15.6 pg/mL。洗滌，加樣酶標(biāo)板加上覆膜，37 ℃溫育1 h，顯色，終止反應(yīng)，測定進(jìn)行試驗(yàn)，該操作嚴(yán)格按照IFN-γ試劑盒說明書進(jìn)行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血清中炎癥因子的水平

與空白組小鼠比較,模型組的炎癥因子水平明顯升高(P<0.01)，表明白塞氏病小鼠的炎癥因子水平顯著升高。給予沙利度胺、三物黃芩湯后，與模型組相比小鼠的炎癥因子水平明顯降低 (P<0.01或P<0.05)，但沙利度胺組與中藥高劑量組之間小鼠的炎癥因子水平無顯著差異(P>0.05)見表1。

表1 各組小鼠炎癥因子水平比較

3.2 各組小鼠P-STAT3蛋白含量的水平

與空白組相比，模型組小鼠的P-STAT3蛋白含量明顯升高(P<0.01)；而給予沙利度胺、三物黃芩湯后，與模型組相比小鼠的P-STAT3蛋白明顯降低(P<0.01或P<0.05)。但沙利度胺組和中藥高劑量組P-STAT3蛋白含量比較無顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表2。

注：A：空白組;B：模型組;C：沙利度胺組;D：三物黃芩湯低劑量治療組;E：三物黃芩湯中劑量治療組;F：三物黃芩湯高劑量治療組。圖1 各組小鼠外周血P-STAT3蛋白比較

表2 各組小鼠外周血P-STAT3蛋白比較

3.3 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第56天時(shí)測量并記錄各組小鼠體質(zhì)量

與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，沙利度胺組及三物黃芩湯高劑量組體質(zhì)量有明顯差異(P<0.01，<0.05)；三物黃芩湯中、低劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠體質(zhì)量比較

4 討論

白塞氏病中醫(yī)病名稱為“狐惑病”，其中醫(yī)發(fā)病機(jī)理多與濕熱相關(guān)，查閱古籍《金匱懸解》：“狐惑者，狐疑惶惑，綿昧不明，狀如傷寒。……此蓋濕氣遏郁，精神昏憒之病也。濕邪淫泆，上下熏蒸，浸漬糜爛，肌肉剝蝕?！比稂S芩湯具有清熱涼血滋陰, 解毒燥濕堅(jiān)陰之效，黃芩、生地黃、苦參均為味苦、性寒之品，黃芩、苦參能夠清熱燥濕除脾胃之濕熱之邪，生地黃滋陰清熱使熱祛而不傷陰津，三物黃芩湯首見于《金匱要略·婦人產(chǎn)后病脈證并治第十二》曰:“婦人在草蓐……頭痛者, 與小柴胡湯, 頭不痛但煩者, 此湯主之?！狈街悬S芩中黃芩苷 (baicalin) 分子式為C21H18O11，是從傳統(tǒng)中藥黃芩中提取的一種經(jīng)過尿嘧啶核甙二磷酸鹽葡萄糖醛酸化的黃酮類葡萄糖醛酸苷， 是黃芩的主要有效成分之一[2]。黃芩苷能夠抑制白介素1β細(xì)胞因子，并且抑制炎癥相關(guān)蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平從而緩解炎癥反應(yīng)，延長細(xì)胞生命力[3]。氧化苦參堿是苦參中的主要起效成分，可以雙向調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖，又能夠抑制TNF-α、IL-6和IL-8等炎癥因子凸顯其抗炎免疫的作用[ 4]。方中生地黃為君藥, 行涼血通利、滋陰益腎的功效, 通過藥理研究發(fā)現(xiàn)功效似糖皮質(zhì)激素免疫抑制作用[5]。綜上所述三物黃芩湯中的三味中藥均有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，同時(shí)在臨床治療白塞氏病患者療效顯著為本研究奠定了研究基礎(chǔ)。

白塞病是一種多系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，具有復(fù)雜的遺傳背景，導(dǎo)致先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的促炎性激活[6-7]。CD4+和CD8+T細(xì)胞都產(chǎn)生Th1型促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素12和干擾素(IFN-γ)在BD的外周血(PB)和炎癥組織中增加[8-9]。Th17細(xì)胞是一個(gè)相對較新的輔助性T細(xì)胞亞群，主要產(chǎn)生白細(xì)胞介素-17A、白細(xì)胞介素-17F、白細(xì)胞介素-22和腫瘤壞死因子(腫瘤壞死因子-α)[10]。最近的數(shù)據(jù)也暗示白細(xì)胞介素-17和Th17型應(yīng)答在BD中參與發(fā)病機(jī)理[11-12]?；钴SBD的特點(diǎn)是白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-23和活化的Th17細(xì)胞血清水平高[13-15]。STAT3在Th17分化和白介素-17產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用[16]。STAT3激活的特征在于STAT3磷酸化，此前的研究表明活躍性白塞氏病患者表現(xiàn)出STAT3磷酸化水平升高[17-18]。JAK/STAT信號通路對于先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活至關(guān)重要。干擾素γ受體、白細(xì)胞介素2R和白細(xì)胞介素6R通過JAK1信號，與JAK2或JAK3配對，而白細(xì)胞介素12和白細(xì)胞介素23通過JAK2/Tyk2途徑激活[19]。STAT3對調(diào)節(jié)Th17的平衡至關(guān)重要以及促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖。STAT3結(jié)合多個(gè)基因，尤其是白介素-6，參與Th17細(xì)胞的分化、激活、增殖和存活，調(diào)節(jié)表達(dá)和表觀遺傳修飾。STAT3在IFN-γ信號通路中也有重要作用，其高度參與大多數(shù)自身免疫過程。因此，STAT3在炎癥和體內(nèi)平衡中協(xié)調(diào)了T細(xì)胞功能的多個(gè)關(guān)鍵方面[20]。有研究已經(jīng)證明JAK1/STAT3信號通路在BD中被激活，可能通過升高血清和組織中Th1/Th17型細(xì)胞因子的表達(dá)[21]。所以抑制STAT的磷酸化在治療白塞病至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)研究通過觀察炎癥因子IFN-γ干擾素、白介素17A的含量及P-STAT3蛋白表達(dá)水平來討論三物黃芩湯在白塞氏病中的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用中藥高劑量組和西藥沙利度胺組治療一個(gè)月后與模型組相比小鼠的炎癥因子水平和P-STAT3蛋白明顯降低，說明三物黃芩湯和沙利度胺均可降低白塞氏病小鼠的炎癥因子和P-STAT3蛋白含量，實(shí)驗(yàn)證明了三物黃芩湯可以降低炎癥因子水平、抑制STAT3的磷酸化，其抑制STAT3的磷酸化可能與JAK1/STAT3信號通路有關(guān)，本文為中藥治療白塞氏病提供新思路。