徐英杰，尹羽薇，付新，陳巍*，董清平，孫羽佳，張宇馳

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.雞西礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院，黑龍江 雞西 158100；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

膝關(guān)節(jié)是骨性關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病的最常見部位，以膝關(guān)節(jié)局部疼痛為主要癥狀，在行走或鍛煉過程中加重，伴有關(guān)節(jié)僵硬、觸痛、腫脹、發(fā)熱等多種體征。本病為臨床中老年人群的常見病，多發(fā)病[1]，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步使人類的預(yù)期壽命大大延長，膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也隨之不斷提高。導(dǎo)師董清平教授從事臨床工作多年，對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機(jī)制有獨(dú)到的見解，治療本病積累了許多成功經(jīng)驗(yàn)，臨癥中運(yùn)用祖國醫(yī)學(xué)理論，將“對(duì)癥”與“對(duì)因”相結(jié)合，總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)方外敷治療骨性關(guān)節(jié)炎，既能緩解臨床癥狀，又能從根本控制病情發(fā)展，達(dá)到標(biāo)本兼顧的治療作用[2]。本實(shí)驗(yàn)采用現(xiàn)代生產(chǎn)工藝，將導(dǎo)師總結(jié)經(jīng)驗(yàn)方藥物有效成分提取，制成“中藥貼膜”，用于治療經(jīng)Hulht造模方法制備兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，通過檢測(cè)治療后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α、HA的含量，進(jìn)一步揭示中醫(yī)藥干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)退變的作用機(jī)理，為臨床治療骨性關(guān)節(jié)炎提供一種療效可靠，簡(jiǎn)單易行，造價(jià)低廉，方便實(shí)用的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭白兔50只(合格證號(hào)SCXK黑2015-003)，3月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

中藥貼膜由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院制劑室在原方[3]基礎(chǔ)上制備而成，其主要成分為骨碎補(bǔ)、川芎、續(xù)斷、延胡索、冰片等。玻璃酸鈉注射液由上海景峰制藥股份有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字 H20000643)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備

將白兔正常飼養(yǎng)觀察無異常后，采用Hulht造模法[4]，建立兔右膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功后，隨機(jī)分成模型對(duì)照組、治療1組、治療2組、治療3組，每組例數(shù)為10只，再選擇同批次健康白兔作為正常組飼養(yǎng)。各組動(dòng)物采用以下方式治療：①治療1組采用與中藥貼膜劑成分相同經(jīng)過普通粉碎方法制成藥粉加入促透劑制成敷貼，進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)外敷治療，1次/日，12 h/次，治療6周。②治療2組于術(shù)后1周開始右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉0.25 mL，1次 /周，治療5周。③治療3組給予中藥貼膜右膝關(guān)節(jié)外敷治療，1次/日，12 h/次，治療6周。④模型對(duì)照組應(yīng)用醫(yī)用橡皮膏，右膝關(guān)節(jié)帖敷治療，1次/日，12 h/次，治療6周。⑤正常組給予正常飼養(yǎng)。

1.3.3 Elisa法測(cè)定關(guān)節(jié)液內(nèi)的IL-1、IL-6、TNF-α含量

治療結(jié)束后，所有動(dòng)物采用空氣栓塞法處死，抽取各組動(dòng)物治療后右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液，采用Elisa法測(cè)定關(guān)節(jié)液內(nèi)的IL-1、IL-6、TNF-α含量，具體操作方法如下：①從冰箱內(nèi)取出標(biāo)本，待其自然解凍。打開試劑盒，常溫放置，充分混勻試劑，注意避免大量氣泡的產(chǎn)生。②樣品在3 000 rpm條件下離心10 min，取上液待測(cè)。嚴(yán)格按說明書將標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋，稀釋前標(biāo)準(zhǔn)品需震蕩混勻。洗滌緩沖液并以蒸餾水50倍稀釋。③將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品做好標(biāo)記，按順序排列，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及空白對(duì)照均做復(fù)孔，樣品根據(jù)數(shù)量盡量做復(fù)孔。④加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL和待測(cè)樣品50 μL于反應(yīng)孔。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上模板，輕輕震蕩混勻，37 ℃溫箱溫育45 min。⑤甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，震蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作4次。每孔加入酶標(biāo)試劑，輕輕震蕩混勻，37 ℃溫箱溫育30 min。⑥甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，震蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作4次。⑦每孔加入底物并震蕩混勻，37 ℃溫箱溫育5 min，避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD值。

1.3.4 放射免疫分析法測(cè)定關(guān)節(jié)液中HA含量

抽取治療后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液，按如下步驟測(cè)定關(guān)節(jié)液中HA含量：①將成500倍的關(guān)節(jié)液稀釋成50 μL與125I標(biāo)記物混合；將透明質(zhì)酸放射免疫分析試劑盒中各標(biāo)準(zhǔn)品與125I標(biāo)記物混合。②在37 ℃水浴標(biāo)本，再加入一抗和二抗各100 μL，離心機(jī)離心15 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，棄上清液。③用免疫計(jì)數(shù)儀測(cè)定沉淀物的放射性并加以記錄。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Elisa法測(cè)定關(guān)節(jié)液IL-1、IL-6、TNF-α結(jié)果分析

經(jīng)過6周治療后，IL-1檢測(cè)結(jié)果為正常組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1含量較低，僅為8.57 ng/L，模型對(duì)照組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1含量明顯增高，約為正常組的37.2倍，治療1組IL-1含量較模型對(duì)照組低，與模型對(duì)照組相比(P<0.01)，治療2組和治療3組在各治療組中含量最低，與治療1組相比有顯著差異(P<0.01)，治療2組、3組IL-1含量比較相差不大(P>0.05)，但均高于正常組(P<0.01)。

IL-6檢測(cè)結(jié)果為正常組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-6含量極低僅為0.09 ng/L，模型對(duì)照組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-6含量在各組別中最高，達(dá)到248.54 ng/L，與正常組相比有極顯著的差異(P<0.01)。應(yīng)用傳統(tǒng)中藥治療6周后，治療1組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-6含量下降至154.14 ng/L，與模型對(duì)照組相比有差異(P<0.01)。治療2組、3組治療6周后，膝關(guān)節(jié)液中IL-6含量下降明顯，與治療1組相比P<0.01。但治療2組與3組比較相差不大(P>0.05)，高于正常組(P<0.01)。

TNF-α檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組膝關(guān)節(jié)液中TNF-α含量明顯升高，與正常組相比有顯著差異(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用傳統(tǒng)中藥治療后，治療1組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)液TNF-α含量較模型對(duì)照組有所降低(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用玻璃酸鈉、中藥貼膜治療后，治療2組、3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右膝關(guān)節(jié)液TNF-α含量較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，均優(yōu)于治療1組，其中治療3組膝關(guān)節(jié)液TNF-α含量檢測(cè)結(jié)果低于治療1組(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α含量測(cè)定結(jié)果

2.2 放射免疫分析法測(cè)定關(guān)節(jié)液HA結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組關(guān)節(jié)液中透明質(zhì)酸含量較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，應(yīng)用傳統(tǒng)中藥、玻璃酸鈉、中藥貼膜治療后關(guān)節(jié)液中透明質(zhì)酸含量較模型對(duì)照組均有提高(P<0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過玻璃酸鈉及中藥貼膜治療后關(guān)節(jié)液中透明質(zhì)酸含量均較治療1組高(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中應(yīng)用玻璃酸鈉治療后關(guān)節(jié)液中透明質(zhì)酸含量高于應(yīng)用中藥貼膜治療(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液中HA含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的中藥貼膜其主要成分為延胡索、川芎、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、冰片。方中延胡索：味辛、苦，性溫。歸肝、脾、心經(jīng)。有活血，行氣，止痛之功效。主治胸脅、脘腹疼痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌撲腫痛之癥。中醫(yī)認(rèn)為，元胡辛散、苦泄、溫通，既入血分，又入氣分，既能行血中之氣，又能行氣中之血，氣暢血行，通則不痛?！侗静菥V目》言：“延胡索專治一身上下諸痛，凡氣血瘀滯，不通則痛，若氣行血活，通則不痛，用之中的，妙不可言?！薄侗静萁?jīng)疏》曰：“延胡索，溫則能和暢，和暢則氣行；辛則能潤而走散，走散則血活。血活氣行，故能主破血及產(chǎn)后諸病因血所為者?！币虼耍酒窞榛钛須庵雇粗妓?。臨床證實(shí)本品配伍當(dāng)歸、川芎、桂枝、赤芍等藥物用于治療四肢血滯疼痛有較好的止痛作用，為中藥中止痛良藥[5]。研究證實(shí)，延胡索中可分離出多種生物堿，其中延胡索甲素、乙素、丑素、癸素均有鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛指數(shù)則以乙素較高，丑素次之，甲素較差，但均不及嗎啡[6]。

川芎：味辛，性溫。歸肝、膽、心包經(jīng)。有活血祛瘀，行氣開郁，祛風(fēng)止痛之功效。主治風(fēng)寒濕痹，跌打損傷，胸脅疼痛，頭痛眩暈，癰疽瘡瘍等癥?！侗窘?jīng)》記載：“川芎主中風(fēng)入腦，寒痹、筋攣緩急……”。本品在臨床為活血行氣之首選要藥，被稱為氣中血藥?，F(xiàn)代研究表明川芎中含有揮發(fā)油、生物堿、多糖等多種成分，其中主成分為藁本內(nèi)酯、3-丁酜內(nèi)酯、香檜烯、川芎嗪、阿魏酸、瑟丹酸、大黃酸、棕櫚酸、香莢蘭醛和亞油酸等[7]，其中川芎嗪能促進(jìn)骨折家兔的骨折愈合和血腫的吸收[8]，且在體外實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)骨細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用[9]。

骨碎補(bǔ)：苦，性溫。歸肝、腎經(jīng)。具有溫補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋健骨，益虛損之功。主治跌撲閃挫，筋骨折傷，腎虛腰痛，耳鳴耳聾，牙齒松動(dòng)等癥，宜浸酒或搗散外用?！堕_寶本草》謂：“骨碎補(bǔ)主破血，止血，補(bǔ)傷折”?！栋Y治要訣》云：“痢后下虛，不善調(diào)養(yǎng)，或遠(yuǎn)行，或房勞，或外感，致兩足痿軟，或痛或痹，遂成痢風(fēng)，宜用獨(dú)活寄生湯，吞虎骨四斤丸，仍以骨碎補(bǔ)三分之一同研，取汁，酒解服之，此亦從腎虛骨痿而治也”?，F(xiàn)代研究表明骨碎補(bǔ)提取物中含有柚皮苷，β-谷甾醇，胡蘿卜苷，肉桂酸，咖啡酸，原兒茶酸多種化合物[10],其中柚皮苷灌胃對(duì)實(shí)驗(yàn)性老年大鼠骨損傷愈合具有促進(jìn)作用[11]。骨碎補(bǔ)水煎灌胃，治療兔骨性關(guān)節(jié)炎，能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡，改善軟骨細(xì)胞功能，推遲細(xì)胞退行性改變，降低骨關(guān)節(jié)病變率[12]，具有刺激骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代償性增生作用，并能部分改善由于力學(xué)應(yīng)力線改變?cè)斐傻年P(guān)節(jié)軟骨退行性變的作用[13]。

續(xù)斷：苦、辛，性微溫。歸肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，續(xù)折傷之功效。主治腰膝酸軟，風(fēng)濕痹痛，崩漏，胎漏，跌撲損傷等癥。其中酒續(xù)斷多用于風(fēng)濕痹痛，跌撲損傷。本品辛溫破散之性，善能活血祛瘀，既有甘溫補(bǔ)益之功，又有壯骨強(qiáng)筋、續(xù)筋接骨、療傷止痛之能，臨床常用其治療跌打損傷，瘀血腫痛，筋傷骨折。其甘溫助陽，辛以散瘀，兼有補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)健壯骨，通利血脈之功用于腰膝酸痛，寒濕痹痛?！侗静菡吩疲骸袄m(xù)斷，用其苦澀。其味苦而重，故能入血分，調(diào)血脈，消腫毒、乳癰、瘰疬、痔痿，治金損跌傷，續(xù)筋骨血脈”?！端幤坊x》謂：“續(xù)斷，苦養(yǎng)血脈，辛養(yǎng)皮毛，善理血脈傷損，接續(xù)筋骨斷折，故名續(xù)斷?！薄侗静菡x》曰：“續(xù)斷，其氣溫和，氣味俱厚，故兼入氣血，能宣行百脈，通利關(guān)節(jié)，凡經(jīng)絡(luò)筋骨血脈諸病，無不主之，而通痹起痿，尤有特長”?，F(xiàn)代研究表明，續(xù)斷中含有皂苷、生物堿、多糖、揮發(fā)油等多種有效成分，其中皂苷能夠能明顯提高間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素的含量[14]，是本品能夠促進(jìn)骨折愈合、防治骨質(zhì)疏松的機(jī)制之一。

冰片：辛、苦，微寒。歸心、脾、肺經(jīng)。具有開竅醒神，清熱止痛之功效。主治熱病神昏，痙厥，中風(fēng)痰厥，氣郁暴厥，中惡昏迷，目赤，口瘡，咽喉腫痛，耳道流膿等癥。本品芳香走竄，具有良好的止痛作用，能清熱而散郁火消腫而止痛。《會(huì)約醫(yī)鏡》云：“冰片治肢解疼痛”。現(xiàn)代藥理研究證明冰片主要成分是近乎純粹的右旋龍腦，具有抗炎止痛作用。而且冰片本身又是一種很好的透皮促進(jìn)劑，川芎配伍冰片后，其所含的川芎嗪透皮吸收性能夠被加強(qiáng)[15]。

IL-1、IL-6和TNF-α在OA軟骨退變中起重要作用，這些細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)和刺激各種酶的活性，從而直接影響關(guān)節(jié)軟骨的代謝。在多項(xiàng)研究中表明，大多數(shù)OA患者的滑液中可發(fā)現(xiàn)IL-1、TNF-α和IL-6，這些細(xì)胞因子都有明顯的變化，它們通過對(duì)局部的刺激，使關(guān)節(jié)軟骨退變加重[16]。

Wood等1983年首先在人類的關(guān)節(jié)炎病變滑液中發(fā)現(xiàn)了可促進(jìn)軟骨分解代謝的細(xì)胞因子，并通過檢測(cè)鑒別出此因子是IL-1；Sabiston等在牛OA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕ぶ幸舶l(fā)現(xiàn)了IL-1；Herman等在人的OA滑膜中也分離出了IL-1，證實(shí)滑膜中確實(shí)存在細(xì)胞因子。IL-1可由單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌，其中以前者為主。在OA中，軟骨細(xì)胞上1L-1感受器及IL-1本身的表達(dá)都有所增加。IL-1能夠誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達(dá)并增強(qiáng)其活性，還能刺激兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成一氧化氮，并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達(dá)，再依次促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-14、9和3合成，在mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上與轉(zhuǎn)換生長因子-β和IL-4起結(jié)抗作用，并與Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸一天冬氨酸)肽和P物質(zhì)協(xié)同作用抑制II型膠原和蛋白聚糖的合成，動(dòng)物關(guān)節(jié)內(nèi)注射重組IL-1可復(fù)制出骨關(guān)節(jié)炎模型，注射IL-1拮抗劑又可阻斷軟骨基質(zhì)成分的降解[17]。有關(guān)研究顯示OA患者關(guān)節(jié)液中IL-1水平與骨關(guān)節(jié)炎軟骨的破壞程度呈高度正相關(guān)[18]，即關(guān)節(jié)液IL-1水平越高，關(guān)節(jié)軟骨的病變程度越重，因此關(guān)節(jié)液IL-1水平能作為一種臨床早期診斷OA的參考性觀測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組動(dòng)物關(guān)節(jié)液中IL-1含量較低，而模型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液中IL-1含量卻明顯增加，表明骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型關(guān)節(jié)液中IL-1含量成增高趨勢(shì)，傳統(tǒng)中藥外敷治療膝骨性關(guān)節(jié)炎也起到了一定的療效，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)液中IL-1含量較模型對(duì)照組減少，但其效果與玻璃酸鈉和中藥貼膜治療后相比有明顯的差別，實(shí)驗(yàn)證實(shí)玻璃酸鈉和中藥貼膜可通過減少關(guān)節(jié)液內(nèi)IL-1的生成,延緩骨關(guān)節(jié)炎病理過程發(fā)展,成為治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的重要原因。

IL-6主要由淋巴樣和某些非淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)活性。IL-6可增強(qiáng)IL-1和TNF-α的效應(yīng)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成多種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。在活動(dòng)期的OA患者血清及關(guān)節(jié)滑液中能檢測(cè)到IL-6。OA患者的T細(xì)胞、B相胞、滑膜以及軟骨細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-6，并與疾病活動(dòng)相關(guān)，骨性關(guān)節(jié)炎患者TNF-α與IL-6等協(xié)同作用，最終導(dǎo)致滑膜炎和軟骨分解[19]。有研究表明，人膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中IL-6濃度與關(guān)節(jié)破壞的X線分級(jí)相關(guān)[20]，提示IL-6也與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)破壞相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了模型對(duì)照組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)液中IL-6含量較正常組明顯增高，在應(yīng)用不同治療方法后，各治療組動(dòng)物關(guān)節(jié)液中IL-6含量均有一定的下降，其中以玻璃酸鈉和中藥貼膜的治療效果最為明顯。實(shí)驗(yàn)表明，中藥貼膜和玻璃酸鈉均可以通過下調(diào)關(guān)節(jié)液中IL-6含量而達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用。

TNF是一類能引起腫瘤組織出血和壞死的細(xì)胞因子，主要來源于外周血和滑膜的單核-巨噬細(xì)胞，參與免疫應(yīng)答、抗腫瘤、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與內(nèi)毒素休克及引起惡病質(zhì)等，其中與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的主要包括：誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，增強(qiáng)白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附；誘導(dǎo)分泌IL-1、IL-6、IL-8、CSF及基質(zhì)金屬蛋白酶等細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)炎癥發(fā)生；激活淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，是T細(xì)胞激活的協(xié)同刺激因子；刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖[21]。TNF-α能刺激軟骨組胞產(chǎn)生大量的基質(zhì)金屬蛋白酶并增強(qiáng)其活性[22]，而對(duì)金屬蛋白酶抑制因子無影響，使基質(zhì)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶抑制因子失平衡。TNF-α也能夠抑制軟骨中II型膠原和蛋白聚糖的合成，使軟骨發(fā)生進(jìn)行性破壞[23]，但其作用弱于IL-1，且它們之間有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示模型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液中TNF-α含量較正常組明顯增加，表明骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中TNF-α含量有增高趨勢(shì)。各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過治療后，在減少關(guān)節(jié)液內(nèi)TNF-α含量都起到了一定的效果，表明各治療藥物都可以通過降低關(guān)節(jié)液內(nèi)的TNF-α含量，達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。在各治療組降低TNF-α含量的作用中，以中藥貼膜的治療效果最為明顯，優(yōu)于玻璃酸鈉和傳統(tǒng)中藥治療。

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)，又稱玻璃酸，于1934年由Meyer等從牛眼玻璃體中分離而得名，它是關(guān)節(jié)液和軟骨基質(zhì)的主要組成成分。人體內(nèi)的透明質(zhì)酸主要由纖維母細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，其主要作用包括：參與細(xì)胞外液中電解質(zhì)和水分的調(diào)節(jié)；關(guān)節(jié)和細(xì)胞間減震及潤滑：屏障和抵御感染；參與修復(fù)創(chuàng)傷和鈣化；促進(jìn)血液凝固；澄清血脂；保持關(guān)節(jié)液的穩(wěn)定；支持和穩(wěn)定滑膜細(xì)胞和膠原支架；對(duì)痛覺的抑制；參與軟骨修復(fù)等多種生理功能[24]。在OA發(fā)病過程中，由于基質(zhì)金屬蛋白酶和其他細(xì)胞因子的作用，致使關(guān)節(jié)滑液中產(chǎn)生較多的自由基，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑液中透明質(zhì)酸分泌量減少，造成OA患者關(guān)節(jié)滑液中透明質(zhì)酸的濃度、分子量和粘彈性均低于正常值。透明質(zhì)酸含量下降使?jié)櫥偷挚箼C(jī)械力作用的生物學(xué)功能產(chǎn)生障礙，作用于關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)力增加，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷，滑膜合成透明質(zhì)酸的功能低下；炎癥過程中白細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的自由基可降解透明質(zhì)酸，如氧自由基可破壞透明質(zhì)酸黏變區(qū)，改變其性質(zhì)，并使之?dāng)嗔?，滑膜炎癥滲出增加又可繼續(xù)造成透明質(zhì)酸濃度降低，引發(fā)惡性循環(huán)。此外，骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中關(guān)節(jié)內(nèi)的積液增多，使關(guān)節(jié)內(nèi)的透明質(zhì)酸進(jìn)一步被稀釋，從而造成關(guān)節(jié)內(nèi)的透明質(zhì)酸含量相對(duì)降低，也是加重骨性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要因素[25]。目前，研究顯示骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中透明質(zhì)酸的含量要明顯低于正常人，因此在治療骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)常常配合采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射玻璃酸鹽的方法[26]，起到了緩解關(guān)節(jié)疼痛，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能的治療作用。研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組關(guān)節(jié)液中透明質(zhì)酸含量明顯低于正常組，表明骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)，關(guān)節(jié)液中透明質(zhì)酸處于較低水平。中藥貼膜和玻璃酸鈉都在治療骨性關(guān)節(jié)炎過程中有較好的提高關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸的作用，可以通過增加關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸含量來達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用。關(guān)節(jié)內(nèi)注射玻璃酸鈉后，關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸含量上升要高于中藥貼膜治療，明顯高于傳統(tǒng)中藥治療，因此注射玻璃酸鈉療法在增加關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸含量的作用上要優(yōu)于中藥貼膜。

本實(shí)驗(yàn)將配置成功的中藥貼膜貼劑應(yīng)用于兔骨性關(guān)節(jié)炎模型，并將治療結(jié)果與應(yīng)用玻璃酸鈉注射劑治療進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果顯示中藥貼膜和玻璃酸鈉都可以通過減低骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6和TNF-α的含量來達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。在改善關(guān)節(jié)液內(nèi)透明質(zhì)酸合成過程方面，研究結(jié)果顯示玻璃酸鈉在提高關(guān)節(jié)液內(nèi)透明質(zhì)酸的含量要優(yōu)于中藥貼膜，這與玻璃酸鈉本身的藥物性質(zhì)有關(guān)，也可能是中藥貼膜在治療過程中要通過透皮吸收等一系列作用后達(dá)到治療效果，從而使藥物起效時(shí)間延長，亦或許是中藥貼膜在透過皮膚表層組織后，在體內(nèi)代謝還受其他相關(guān)因素的控制，從而致使中藥貼膜在促進(jìn)透明質(zhì)酸生成的作用較玻璃酸鈉低。相比而言，中藥貼膜雖然在促進(jìn)關(guān)節(jié)透明質(zhì)酸生成方面弱于玻璃酸鈉，但卻可以從根本上對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞因素進(jìn)行(如MMP-1)進(jìn)行干預(yù)[27]，從而從標(biāo)、本兩方面對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎起到良好的治療作用，其綜合治療結(jié)果要優(yōu)于玻璃酸鈉。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)中藥貼膜在治療骨性關(guān)節(jié)炎過程中能夠改善骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α、HA等關(guān)鍵指標(biāo)，為預(yù)防膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎提供直觀的參考依據(jù)。