胡 曉，周 雅,2，陳星星,2，李來好,*，楊賢慶，陳勝軍，吳燕燕，楊少玲

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

自由基是生物體在氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，當(dāng)自由基的產(chǎn)生和清除無法平衡時(shí)，過量的自由基會(huì)破壞超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶等關(guān)鍵酶類，并通過氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等對(duì)機(jī)體組織及細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體衰老、癌癥和心血管病等各種疾病的發(fā)生[1]，因此使用抗氧化劑減少機(jī)體的氧化損傷成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)。此外，食品中的脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)易于氧化，會(huì)導(dǎo)致食品品質(zhì)下降，縮短其貨架期，以致于需在食品生產(chǎn)及儲(chǔ)運(yùn)過程中添加抗氧化劑，但目前常用的人工合成抗氧化劑會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的不良影響，甚至與癌癥的發(fā)生有關(guān)[2]。因此，亟需尋找安全、無毒的天然抗氧化活性物質(zhì)?？寡趸钚噪氖且环N具有清除體內(nèi)自由基和抑制生物大分子過氧化作用的生物活性肽，具有較高的抗氧化活性和安全性，應(yīng)用前景十分廣闊。

水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量高且營養(yǎng)豐富，已成為近年來國內(nèi)外制備抗氧化肽的重要原料[2-6]。從水產(chǎn)抗氧化肽的相關(guān)研究結(jié)果來看，其分子質(zhì)量大多主要分布在300～1 500 Da之間，其肽鏈通常含有一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸殘基（Gly、Leu、Ala、Pro等）、親核含硫氨基酸殘基（Cys、Met）、芳香族氨基酸殘基（Phe、Trp、Tyr）以及含有咪唑環(huán)的組氨酸殘基（His）。此外，多肽中氨基酸的位置及序列也與其抗氧化活性有關(guān)，如堿性氨基酸位于肽段的C端會(huì)使其具有更高的自由基清除能力[7]。盡管國內(nèi)外對(duì)抗氧化活性肽已經(jīng)開展了大量研究，但其氨基酸組成特征、構(gòu)效關(guān)系以及作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。羅非魚是我國大宗養(yǎng)殖魚類，產(chǎn)量位居世界首位，其肉的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)19%，且所含氨基酸種類齊全、比例合理，是利用生物酶解法制備功能性肽的理想原料來源，但目前羅非魚肉的加工利用主要以冷凍羅非魚片為主，產(chǎn)品的附加值較低，其蛋白質(zhì)高值化利用程度有待進(jìn)一步提高，因此研究羅非魚肉的精深加工及高值化利用具有十分重要的意義[8-10]。目前，以羅非魚肉為原料，采用不同的蛋白酶對(duì)其水解制備抗氧化活性肽已有報(bào)道[11-13]。由于羅非魚肉蛋白主要由肌原纖維蛋白、肌漿蛋白與基質(zhì)蛋白構(gòu)成，而不同組分蛋白及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性可能會(huì)存在較大差異。因此，以羅非魚肌肉蛋白組分為研究對(duì)象，篩選并分離富集出高活性組分的蛋白源抗氧化肽，可為羅非魚抗氧化肽的研究與開發(fā)提供重要依據(jù)。本研究采用木瓜蛋白酶對(duì)羅非魚肌肉蛋白組分進(jìn)行酶解，比較并探討不同組分蛋白其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，并通過超濾、凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對(duì)活性較高的肌漿蛋白源抗氧化肽進(jìn)行了分離純化，同時(shí)對(duì)其氨基酸組成予以分析，旨在為羅非魚精深加工及高值化利用提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚購于廣州華潤萬家超市，取魚肉，洗凈瀝干，絞碎，置于聚乙烯袋中于-20 ℃凍藏備用。

木瓜蛋白酶 廣東江門拜奧生物化學(xué)廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，D P P H）、細(xì)胞色素c（1 2 4 0 0 D a）、抑肽酶（6 511.83 Da）、維生素B12（1 355.37 Da）、氧化型谷胱甘肽（612.63 Da）、還原性谷胱甘肽（307.32 Da）美國Sigma公司；鄰二氮菲 上海韶遠(yuǎn)化學(xué)科技有限公司；鄰苯三酚 廣州菲博生物科技公司；三氟乙酸、乙腈、甲醇（均為色譜純） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；BS 224S型電子精密天平 德國Sartorius公司；Delta320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；UV2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；T50均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；SUNRISE酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；3K30型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器 金壇精達(dá)儀器制造廠；超純水系統(tǒng)、Labscale TFF system小型切向流超濾系統(tǒng)美國Milipore公司；Sephadex G-25 美國GE公司；1100型高效液相色譜、C18半制備柱（9.4 mm×250 mm，5 μm）、C18分析柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）、Elicpse AAA柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚肉不同組分蛋白的分離制備

羅非魚肉不同組分蛋白參照課題組前期研究的方法[14]進(jìn)行制備。各組分蛋白的提取率為提取得到的各組分蛋白質(zhì)量與羅非魚肉蛋白的質(zhì)量比。

1.3.2 羅非魚肉不同組分蛋白酶解產(chǎn)物的制備

將提取的各組分蛋白用蒸餾水（4 ℃）稀釋成蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約4%的溶液，勻漿后，將蛋白溶液pH值調(diào)節(jié)至6.0，加入蛋白溶液中蛋白質(zhì)量2.5%的木瓜蛋白酶，60 ℃下恒溫水浴振蕩酶解1、2、4、6、8 h。酶解至終點(diǎn)時(shí)于沸水中滅酶15 min，冷卻后離心（10 000 r/min、4 ℃，10 min），取上清液抽濾，濾液即為不同組分蛋白酶解液。

1.3.3 羅非魚肉不同組分蛋白酶解液的超濾分離

將酶解液在室溫下通過截留分子質(zhì)量分別為10 kDa與5 kDa的超濾膜，收集截留液和濾過液，所得組分分別記為TSPH-1（10 kDa以上）、TSPH-2（5～10 kDa）、TSPH-3（5 kDa以下），將各組分冷凍干燥后配制成質(zhì)量濃度為3 mg/mL的溶液用于測(cè)定抗氧化活性。

1.3.4 凝膠過濾色譜分離

將超濾分離所得抗氧化活性最高的組分經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾后，利用Sephadex G-25凝膠柱予以進(jìn)一步分離純化。色譜分離條件：進(jìn)樣量為1 mL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為50 mg/mL，以超純水作為洗脫液，洗脫液流速為1.0 mL/min，在215 nm波長處多次重復(fù)進(jìn)樣收集各分離峰組分，冷凍干燥后測(cè)定其抗氧化活性。同時(shí)以細(xì)胞色素c（12 400 Da）、抑肽酶（6 511.83 Da）、維生素B12（1 355.37 Da）、氧化型谷胱甘肽（612.63 Da）、還原性谷胱甘肽（307.32 Da）作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定樣品的分子質(zhì)量。

1.3.5 RP-HPLC分離

取凝膠過濾色譜分離所得抗氧化活性最高的組分，采用RP-HPLC C18半制備柱予以進(jìn)一步分離純化。色譜分離條件：進(jìn)樣量為100 μL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸，流動(dòng)相B為乙腈，流速為2.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長為215 nm，梯度洗脫。多次重復(fù)進(jìn)樣收集各分離峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥測(cè)定其抗氧化活性。

將C18半制備柱分離富集得到的抗氧化活性最高的峰組分用C18分析柱鑒定其純度，色譜分離條件：洗脫液為體積分?jǐn)?shù)25%甲醇溶液，洗脫流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長為215 nm。

1.3.6 氨基酸組成分析

氨基酸組成分析按照GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法進(jìn)行。

1.3.7 ·OH清除能力的測(cè)定

參照J(rèn)in Ming等[15]的方法并有所修改。取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，與0.4 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）混勻后加入0.6 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，加入樣品溶液2 mL后充分搖勻，再加入0.4 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%的H2O2溶液混勻，37 ℃條件下水浴1 h，于536 nm波長處測(cè)得吸光度A1；以去離子水代替樣品和H2O2溶液重復(fù)上述操作，測(cè)得吸光度A2；以去離子水代替樣品重復(fù)上述操作，測(cè)得吸光度A3。按公式（1）計(jì)算·OH清除率。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照Bae等[16]的方法并稍作修改。取2 mL樣品溶液，加入2 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液（用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液溶解），混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測(cè)定吸光度A1，對(duì)照組以2 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液代替DPPH溶液，于517 nm波長處測(cè)定吸光度A2，空白組為2 mL DPPH溶液加2 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液，于517 nm波長處測(cè)定吸光度A3。按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.9 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

參照Markhund等[17]的方法并有所修改。取0.2 mL樣品溶液，加入5.6 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），混勻后在25 ℃中水浴10 min，再加入0.2 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液，振蕩搖勻后立即在325 nm波長處測(cè)定吸光度，測(cè)定時(shí)間為5 min，每30 s讀數(shù)一次。以0.2 mL去離子水加5.6 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）調(diào)零，對(duì)照組以去離子水代替樣品。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率，按公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：v1為樣品組的鄰苯三酚自氧化速率；v2為對(duì)照組的鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.10 還原力測(cè)定

參照Ahmadi等[18]的方法并稍作修改。取1 mL樣品液，加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.6）和1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后50 ℃下水浴20 min，加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后10 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，加入1 mL去離子水和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液，混勻后50 ℃水浴10 min，在700 nm波長處測(cè)定其吸光度，以A700nm代表還原力。用去離子水代替樣品作為空白對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚肉各組分蛋白提取率

采用本實(shí)驗(yàn)的分離方法，羅非魚肉各組分蛋白提取率的大小為：肌原纖維蛋白＞肌漿蛋白＞基質(zhì)蛋白。其中，基質(zhì)蛋白的提取率為（5.62±0.13）%，高于草魚（3.12%）等魚類[19]；肌漿蛋白的提取率為（28.11±0.53）%，高于鳙魚（26.14%）[19]，但低于鯽魚（33.23%）等魚類[19]；肌原纖維蛋白的提取率為（62.14±1.12）%，與鯉魚相近（62.87%）[19]。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)各組分蛋白酶解物抗氧化活性的影響

2.2.1 不同組分蛋白酶解物的DPPH自由基清除率

各組分蛋白酶解物的DPPH自由基清除率如圖1所示，肌漿蛋白在酶解4 h時(shí)的DPPH自由基清除率達(dá)到最高，為84.61%；基質(zhì)蛋白和肌原纖維蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率較為接近，均在酶解1 h時(shí)清除率達(dá)到最高，分別為32.34%和31.35%。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)羅非魚各組分蛋白酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on DPPH radical scavenging capacity of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

對(duì)比羅非魚3 種組分蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率可知，肌漿蛋白酶解物明顯高于肌原纖維蛋白和基質(zhì)蛋白酶解物。陳星星等[14]用中性蛋白酶對(duì)羅非魚肉不同組分蛋白進(jìn)行酶解，得到肌漿蛋白酶解物DPPH自由基的半清除質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為3.554 mg/mL，顯著低于肌原纖維蛋白（14.886 mg/mL）和基質(zhì)蛋白酶解物（13.389 mg/mL）的IC50，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。

2.2.2 不同組分蛋白酶解物的·OH清除率

·OH是化學(xué)性質(zhì)非常活潑的一種活性氧，在活性氧中其危害性最大，一旦與物質(zhì)接觸，幾乎可以在瞬間發(fā)生反應(yīng)[20]。·OH可以通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，反應(yīng)式為Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-，鄰二氮菲-Fe2+會(huì)被·OH氧化成鄰二氮菲-Fe3+，從而使536 nm波長處最大吸收峰消失，當(dāng)有抗氧化物存在時(shí)，抗氧化物會(huì)抑制·OH將鄰二氮菲-Fe2+氧化成鄰二氮菲-Fe3+，顏色變化明顯，從而能夠判斷出抗氧化物對(duì)·OH的抑制情況[21]。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)羅非魚各組分蛋白酶解物·OH清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydroxyl radical scavenging capacity of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

各組分蛋白酶解產(chǎn)物清除·OH的能力如圖2所示，肌漿蛋白酶解物對(duì)·OH的清除率隨著酶解時(shí)間的延長先呈上升趨勢(shì)，在4 h時(shí)達(dá)到最大，為50.01%；而繼續(xù)延長酶解時(shí)間，其清除率逐步下降；基質(zhì)蛋白酶解物的·OH清除率在酶解1 h時(shí)達(dá)到最高，為26.67%，隨后降低；肌原纖維蛋白酶解物對(duì)·OH的清除率隨著酶解時(shí)間的延長呈緩慢下降的趨勢(shì)，清除率最高為11.67 %。

對(duì)比3 種組分蛋白酶解物·OH的清除能力可知，清除率的大小順序?yàn)榧{蛋白酶解物＞基質(zhì)蛋白酶解物＞肌原纖維蛋白酶解物，說明采用木瓜蛋白酶酶解時(shí)，肌漿蛋白酶解物是羅非魚肌肉蛋白酶解物中·OH清除能力最高的組分。酶解物樣品的·OH清除率變化趨勢(shì)與DPPH自由基清除率結(jié)果相一致。

2.2.3 不同組分蛋白酶解物的超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子具有很強(qiáng)的活性，能夠使多糖解聚、核酸鏈斷裂，并引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，造成線粒體氧化磷酸化作用的改變以及膜損傷等[22-23]。生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基可以通過歧化反應(yīng)生成H2O2，H2O2可以與Fe2+或Cu2+等離子生成氧化性更強(qiáng)的·OH。本研究采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定酶解物超氧陰離子自由基清除率，鄰苯三酚在堿性環(huán)境下自氧化可以生成超氧陰離子自由基，并產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物，當(dāng)有抑制物存在時(shí)，超氧陰離子自由基被清除，有色中間產(chǎn)物積累減少；因此，可通過檢測(cè)有色中間產(chǎn)物的含量來評(píng)價(jià)樣品的超氧陰離子自由基的清除能力。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)羅非魚各組分蛋白酶解物超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on superoxide anion radical scavenging capacity of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

羅非魚各組分蛋白酶解物對(duì)超氧陰離子自由基清除率如圖3所示，3 種組分蛋白均在酶解2 h時(shí)具有最高的超氧陰離子自由基清除活性，其中肌漿蛋白酶解物清除活性最高，為19.80%；基質(zhì)蛋白酶解物與肌原纖維蛋白酶解物的清除活性無明顯差異，分別為17.97%和18.03%。3 種蛋白酶解物超氧陰離子自由基清除率均在酶解1～2 h快速上升，2～8 h呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。從結(jié)果來看，肌漿蛋白是羅非魚肉蛋白組分中制備高抗氧化活性酶解產(chǎn)物的最適組分。

2.2.4 不同組分蛋白酶解物的還原力

圖4 酶解時(shí)間對(duì)羅非魚各組分蛋白酶解物還原力的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on reducing power of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

還原力能夠衡量抗氧化劑供電子能力的強(qiáng)弱。由圖4可知，肌漿蛋白酶解物的還原力隨酶解時(shí)間延長的趨勢(shì)與其清除DPPH自由基、·OH活性的變化趨勢(shì)相似，均在酶解4 h時(shí)達(dá)到最高值，且其還原力（0.629）明顯高于基質(zhì)蛋白和肌原纖維蛋白酶解物。馬賽蕊[13]與王強(qiáng)[24]等對(duì)羅非魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的產(chǎn)物具有較高的還原力，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明羅非魚木瓜蛋白酶水解物中高還原力組分主要來源于肌漿蛋白。

綜合上述不同酶解時(shí)間各組分蛋白酶解物的抗氧化活性，本研究以抗氧化活性最高的肌漿蛋白酶解物（4 h）為對(duì)象，通過超濾、凝膠過濾色譜等分離技術(shù)，分離富集具有高活性的抗氧化肽。

2.3 肌漿蛋白酶解液超濾分離及各組分的抗氧化活性

圖5 TSPH超濾組分的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of the fractions obtained from TSPH by ultrafiltration

如圖5所示，超濾分離后各組分均具有一定的抗氧化活性，同時(shí)分子質(zhì)量最小的超濾組分TSPH-3具有最高的抗氧化活性，其對(duì)DPPH自由基、·OH、超氧陰離子自由基的清除率及還原力最高，分別為57.79 %、16.81%、13.56%和0.476。郝更新等[25]用超濾法對(duì)牡蠣蛋白的抗氧化活性肽進(jìn)行了分離富集，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于4 kDa組分的抗氧化活性高于原液及其他超濾組分。郭善廣等[26]對(duì)羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解物的超濾分離組分進(jìn)行了抗氧化活性分析，發(fā)現(xiàn)各組分的抗氧化活性大小順序依次為5 kDa以下組分、5～10 kDa組分、10 kDa以上組分，這與本研究結(jié)果相一致。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)小分子質(zhì)量的蛋白肽抗氧化活性并不一定最高，張爽等[27]研究發(fā)現(xiàn)鮑魚外套膜酶解物分子質(zhì)量為3～5 kDa的組分對(duì)·OH和DPPH自由基的清除能力要高于分子質(zhì)量小于1 kDa的組分，說明肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量相關(guān)，但同時(shí)可能也會(huì)受到其氨基酸組成與序列的影響。

2.4 凝膠過濾色譜分離及各組分的抗氧化活性

選擇超濾分離后抗氧化活性最高的TSPH-3組分予以進(jìn)一步的分離純化。圖6為TSPH-3的凝膠過濾分離色譜圖。經(jīng)凝膠過濾分離后，主要富集得到4 個(gè)組分峰，分別標(biāo)記為E1、E2、E3、E4，其中E1組分出峰時(shí)間最早，表明其分子質(zhì)量最大，E4組分出峰時(shí)間最晚，表明其分子質(zhì)量最小。通過分子質(zhì)量計(jì)算，各組分峰的分子質(zhì)量分布范圍為：1.7 kDa以上（E1）、1.7～0.8 kDa（E2）、0.8～0.3 kDa（E3）、0.3 kDa以下（E4）。

圖6 TSPH-3組分的凝膠過濾分離色譜圖Fig.6 Gel filtration chromatogram of TSPH-3

將凝膠色譜分離所得各組分峰收集后冷凍干燥，分別配制成3 mg/mL溶液后測(cè)定其DPPH自由基清除率及還原力，結(jié)果如圖7所示。比較各組分峰對(duì)DPPH自由基的清除活性可看出，E3組分的清除率明顯高于其他各組分，其清除率高達(dá)83.61%。此外，E1、E2、E4組分的DPPH自由基的清除率均低于TSPH-3組分。對(duì)比各組分的還原力可知，E3組分還原力為0.953，其與E4組分還原力差異不明顯，而E1和E2組分的還原力較低，分別為0.235、0.319。綜合上述抗氧化活性結(jié)果可知，E3組分（0.8～0.3 kDa）的抗氧化活性最強(qiáng)，可予以進(jìn)一步分離純化，富集出高活性抗氧化肽。

圖7 凝膠過濾色譜分離組分的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of the fractions obtained from TSPH-3 by gelhk Lltration chromatography

2.5 RP-HPLC分離及各組分的抗氧化活性

圖8 為E3組分的RP-HPLC（半制備柱）分離色譜圖。經(jīng)RP-HPLC分離后，主要富集得到9 個(gè)組分峰，依次標(biāo)記為F1～F9。

圖8 E3組分的RP-HPLC分離色譜圖Fig.8 RP-HPLC profile of E3

收集經(jīng)RP-HPLC分離純化得到的9 個(gè)組分峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，測(cè)定各組分峰的DPPH自由基IC50，結(jié)果如圖9所示。通過比較各組分峰的DPPH自由基IC50可知，F(xiàn)4組分的IC50最低，為0.78 mg/mL，表明F4組分的抗氧化活性最高。此外，通過對(duì)比分離前后不同組分的DPPH自由基清除率可知，F(xiàn)4組分的清除活性比E3組分提高了2 倍以上，比羅非魚肌漿蛋白提高了5 倍以上（1 mg/mL的F4 DPPH自由基清除率為86.73%，3 mg/mL的E3 DPPH自由基清除率為83.61%，6 mg/mL的羅非魚肌漿蛋白DPPH自由基清除率為84.61%）。由此可知，通過超濾、凝膠過濾色譜、RP-HPLC可將羅非魚肌漿蛋白源高活性抗氧化肽予以有效地分離富集。

圖9 RP-HPLC分離各組分的抗氧化活性Fig.9 Antioxidant activity of the fractions obtained from E3 by RP-HPLC

對(duì)抗氧化活性最高的F4組分予以收集，用C18分析柱對(duì)其純度進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖10所示。F4組分只洗脫出一個(gè)主峰，出峰時(shí)間在8.512 min，無其他明顯的雜質(zhì)峰?？傮w來看，F(xiàn)4組分純度較高。

圖10 F4組分的RP-HPLCFig.10 RP-HPLC profile of F4

2.6 F4組分氨基酸組成分析結(jié)果

對(duì)高活性抗氧化肽（F4組分）的氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。一些氨基酸如色氨酸、酪氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等通常被認(rèn)為是具有一定抗氧化活性的氨基酸[4,28]。由表1可知，F(xiàn)4組分中組氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸含量較高，其中含量最高的3 種氨基酸為色氨酸、甘氨酸、組氨酸，其相對(duì)含量分別高達(dá)31.20%、27.25%和8.97%，三者含量占總氨基酸含量的67.42%。F4組分富含的氨基酸中，色氨酸是一種芳香族氨基酸，較易釋放質(zhì)子提供給缺電子的自由基，從而使自由基淬滅[29]；組氨酸含有的咪唑環(huán)可以螯合金屬離子，從而抑制由金屬離子催化或促進(jìn)產(chǎn)生的氧化反應(yīng)，使得肽段具有較好的抗氧化活性[30]；甘氨酸是一種分子中同時(shí)含有酸性和堿性官能團(tuán)的氨基酸，其是強(qiáng)抗氧化劑谷胱甘肽的重要組成氨基酸，同時(shí)也是海參蛋白源和海水魚蛋白源抗氧化肽的主要組成氨基酸[31-32]。由此可知，F(xiàn)4組分的高抗氧化活性與其氨基酸組成存在重要聯(lián)系。

表1 F4組分的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of F4

3 結(jié) 論

采用木瓜蛋白酶對(duì)羅非魚不同肌肉蛋白組分進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)羅非魚肌漿蛋白酶解物的抗氧化活性高于肌質(zhì)與肌原纖維蛋白酶解物，且羅非魚肌漿蛋白酶解4 h時(shí)的產(chǎn)物（TSPH）具有最高的抗氧化活性，其DPPH自由基、·OH清除率和還原力分別為84.61%、50.01%和0.629。同時(shí)，利用超濾對(duì)羅非魚肌漿蛋白中的高活性抗氧化肽進(jìn)行了分離純化，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于5 kDa的肽組分具有較高的抗氧化活性，再經(jīng)凝膠過濾色譜分離后發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為0.8～0.3 kDa的肽組分抗氧化活性最高。最后，通過RP-HPLC分離得到的高活性抗氧化肽F4，其DPPH自由基IC50為0.78 mg/mL，其活性比羅非魚肌漿蛋白提高了5 倍以上，經(jīng)氨基酸分析發(fā)現(xiàn)其富含色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His），相對(duì)含量分別高達(dá)31.20%、27.25%和8.97%，占總氨基酸含量的67.42%。